2014 Fiscal Year Annual Research Report
ヘテロクロマチン構造の確立と維持を制御する分子機構
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26291072
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
中山 潤一 名古屋市立大学, その他の研究科, 教授 (60373338)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 遺伝子 / 発現制御 / ヘテロクロマチン / 分裂酵母 / ユビキチン化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
真核生物の染色体機能に必須なヘテロクロマチン形成の分子メカニズムを明らかにすることを目的として、本年度は以下の２つの研究を遂行した。
【研究項目１：CLRC複合体の動態解析】分裂酵母のヒストンメチル化酵素であるClr4は、Rik1、Cul4、Raf1、Raf2とともにCLRC複合体を形成しており、ユビキチン化との関連が示唆されているがその詳細は不明である。本年度はまずCLRCの構成因子であるRik1にTAPタグを付加した分裂酵母株を作成し、アフィニティー精製によってCLRC複合体の精製を進めた。最終産物を質量分析で解析したところ、以前の報告通り各構成因子の存在が確認されたことから、きちんとCLRC複合体が精製できたと考えられる。次にRik1を除く他の因子を欠損させた酵母株で同様にCLRC複合体を精製したところ、Raf1、Raf2の欠損株ではRik1以外の因子がほとんど解離してしまったのに対して、Clr4の欠損株ではClr4以外の構成要素が確認された。以上の結果より、Raf1とRaf2がCLRC複合体の形成に重要な役割を果たし、Clr4はCLRCコア複合体に弱く相互作用している構成要素であることが示唆された。
【研究項目２：CLRC複合体のユビキチン化基質の同定】上記研究項目1でアフィニティー精製したCLRC複合体を使って、in vitroユビキチン化反応系の構築を試みた。過去の報告に従ってE1、E2、ユビキチンを用意し、CLRC複合体の有無でユビキチン化活性が認められるか調べたところ、実際にポリユビキチン化のシグナルが確認されたことから、精製したCLRCがユビキチン化活性を持つことが分かった。次に候補となる基質を使ってCLRCの基質になり得るか検討したところ、ヒストンH3が効率の良い基質になることを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
予定通りCLRC複合体の精製に成功し、実際に各構成要素の関係が明らかになったことは高く評価できる。また、これまで基質が明らかにされていなかったCLRC複合体に関して、その候補としてヒストンH3を同定できたことは大きな成果であり、今後の発展が期待できる結果であると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の研究計画では、【研究項目１】の研究を展開してバキュロウィルスを用いて各構成要素を単離し、生化学的な性質を調べる予定にしていたが、【研究項目２】の結果を踏まえて、今後は【研究項目２】の方に重点を置き、基質残基の特定とin vivoでの検証を中心的に進める予定である。
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| Causes of Carryover |
当初計上した予算のうち、物品費と旅費の実支出が当初考えた金額よりも少なくなった。旅費については、本研究提案に関して発表した国内研究会がいずれも招待講演であったため、旅費を支出する必要がなかったのが理由である。物品費に関して、当初タンパク質複合体の精製にかかる費用、質量分析にかかる費用を考えて経費を見積もっていたが、実際には予想よりも少ない出発材料で精製ができたため、低く抑えられてしまったと考えられる。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
物品費に関して、本年度の研究成果を下にして、次年度は新たに抗体作成や質量分析に費用がかかると見込まれるので、その分に充てたいと考えている。また旅費に関しては、次年度には本研究成果を海外の国際学会で発表したいと考えているので、そのための費用に充てたいと考えている。
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Research Products
(2 results)
