メロン遺伝資源を活用した日持ち性に関する分子生物学的解析

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26292018
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 中野 龍平 岡山大学, 環境生命科学研究科, 准教授 (70294444)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 加藤 鎌司 岡山大学, 環境生命科学研究科, 教授 (40161096) ; 村上 賢治 石川県立大学, 公私立大学の部局等, 教授 (40200266) ; 高居 恵愛 石川県立大学, 公私立大学の部局等, 准教授 (70589770)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: メロン / 果実成熟 / 老化 / 日持ち性 / 軟化 / エチレン / Genotyping by Sequence / RNA-seq

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、申請グループが保有するメロン遺伝資源を活用し、公開されたメロン全ゲノムや次世代シークエンサーによる解析手法と組合せた、日持ち性に関する研究を目的としている。本年度には以下の結果が得られた。
1)B2メロンが持つ日持ち性の向上に関わる遺伝的変異の探索： B2は外生的にエチレンを処理しても、軟化は誘導されず、日持ち性が良いことが明らかとなった。そこで、通常のメロン春系３号とのRNA-Seq解析による網羅的な発現比較を進めた。
2) ハミウリが持つ日持ち性向上因子の遺伝的、分子生物学的同定：ハミウリとシャランテの交配後代の中に、a)自己触媒的エチレン誘導および軟化とも抑制される系統とb)軟化のみ抑制される２タイプの日持ち性の良い系統が見出された。これらをシャランテへ戻し交雑を継続しつつ、日持ち性の良い系統の選抜した。現在、BC4F2世代まで得られているがタイプaの後代からタイプbの個体が出現することなどが明らかとなった。
3) ハネーデューが持つ日持ち性向上因子の分子生物学的解析：ハネーデューとシャランテのRNA-Seq比較より、発現パターンの異なる細胞壁分解関連酵素遺伝子や転写因子が見つかった。ハネーデューとシャランテの交配F2後代約100個体関して、Genotyping By Sequencing (GBS)解析の結果、多数のSNPSが得られ、表現型（自己触媒的エチレン生成の有無）とSNPSとの連鎖性の解析を進めている。
4)幅広い系統に応用可能なメロン遺伝子組換え体の作成法の確立およびその活用：シャランテでは、通常のカナマイシン耐性に加え、バスタ耐性を利用した抗生物質選抜を実施した。カナマイシンでは50mg/L, バスタでは2～5mg/Lが最適選抜濃度であった。一般的なホルモン組成では、メロン系統により葉切片からの個体再生率が大きく異なった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

以下のように、一部、やや遅れている項目があるが、対応策などは取られており、ほぼ順調に進展している。
1)B2メロンが持つ日持ち性の向上に関わる遺伝的変異の探索： B2は外生エチレン処理下でも軟化しない特徴が明らかとなっており、通常のメロン春系３号とのRNA-Seq解析による網羅的な発現比較を進めているが、一部のサンプルにおいて解析精度が悪く、再解析に向けて、サンプルを調整した。
2) ハミウリが持つ日持ち性向上因子の遺伝的、分子生物学的同定：ハミウリとシャランテの交配後代の中に、２タイプの日持ち性の良い系統が見出されており、BC4F2世代まで得られている。さらに戻し交雑を継続しつつ、日持ち性の良い系統の選抜することで、日持ち性遺伝子の同定に向けて、遺伝的バックグランドがシャランテに近く、日持ち性の良い集団を作成が進展している。
3) ハネーデューが持つ日持ち性向上因子の分子生物学的解析：ハネーデューとシャランテの交配F2後代に関するGenotyping By Sequencing (GBS)解析により、多数のSNPSが得られ、表現型との連鎖性の解析を進めている。より正確な解析のために、一部の個体や親系統に関して追加のGBS解析が必要な状況となったが、すでに解析用サンプルの調整は進んでいる。RNA-Seq解析では、異なる機構にて日持ち性の良いB2も含めた比較解析により、さらに詳細な検証が可能な状況が整っている。
4)幅広い系統に応用可能なメロン遺伝子組換え体の作成法の確立およびその活用：一般的なホルモン組成では、メロン系統により葉切片からの個体再生率が大きく異なっており、幅広い系統に応用可能な状況になっていない。但し、オーキシンとサイトカイニンの濃度比を100倍ほど大きくすることにより、様々な系統における高い再分化効率が報告され、この手法の導入により、現状を打開できる状況になった。

Strategy for Future Research Activity

本研究では、申請グループが保有するメロン遺伝資源を活用し、次世代シークエンサーによる解析との組合せにより、メロン果実の日持ち性に関する解析を目的としている。本年はこれまでの成果を生かし、以下の研究を計画している。
１）B2メロンが持つ日持ち性の向上に関わる遺伝的変異の探索：B2は外生エチレン下でも軟化しない特徴を持つことが明らかとなった。B2と通常メロンの春系３号に関して、RNA-seq解析による比較をさらに進め、発現レベルに加え、重要遺伝子の塩基配列の比較も試みる。また、B2と春系３号の交配後代おいて、外生エチレン有無の条件下にて、日持ち性やエチレン感受性に関連する複数因子の遺伝様式を調査する。
２) ハミウリ持つ日持ち性向上因子の遺伝的、分子生物学的同定：ハミウリとシャランテの交配後代の中に、２タイプの（自己触媒的エチレン誘導と軟化とも抑制、軟化のみ抑制）日持ち性の良い系統が見出された。戻し交雑を継続し、BC5F2世代について、日持ち性の良い系統の選抜し、日持ち性遺伝子の同定に向け、遺伝的バックグランドがシャランテに近く、日持ち性の良い集団を育成する。
３）ハネデューが持つ日持ち性向上因子の分子生物学的解析：ハネデューは自己触媒的エチレン誘導が抑制され、日持ち性が良い。ハネデューとシャランテのF2後代のGBS解析を継続しつつ、ハネデュー、B2、日持ち性の悪いシャランテと春系３号に関して、RNA-seq解析による複合的比較を試みる。ハネデューとハミウリのF1の日持ち性を調査し、両者の日持ち性関連遺伝子座の相異性を確認する。
４）幅広い系統に応用可能なメロン遺伝子組換え体の作成法の確立およびその活用：メロン系統ごとに、ホルモン組成など葉切片からの再生に最適な条件を探索するとともに、Bar遺伝子によるバスタ耐性による選抜を利用した遺伝子組換え体の作成方法の確立を試みる。

Causes of Carryover

B2と春系３号のRNA-seqデータ、ハネーデューとシャランテのRNA-seqデータについて、それぞれ解析を進めた結果、一部のサンプルに関して、シークエンスデータの精度が低いものがあることが明らかとなり、再解析のためのサンプルの調整を進めた。サンプルの調整は完了したが、RNA-seq分析を発注した場合に、年度内に完了しない可能性があったために、次年度に使用することとした。同じく、ハネーデューとシャランテのF2後代のGBS解析においても親系統など追加のシークエンス分析の委託が必要となり、サンプルを調整したが、確実は年度内の完了のために、分析の発注を次年度以降にした。

Expenditure Plan for Carryover Budget

すでに、サンプルの調整は進んでおり、予定通り、B2と春系３号のRNA-seq、ハネーデューとシャランテのRNA-seq、ハネーデューとシャランテのF2世代および親系統のGBS解析に使用する計画である。