2016 Fiscal Year Annual Research Report
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26292026
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
小林 括平 愛媛大学, 農学研究科, 教授 (40244587)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
関根 健太郎 琉球大学, 農学部, 准教授 (30574058)
舘田 知佳 公益財団法人岩手生物工学研究センター, 園芸資源研究部, 研究員 (30774111)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 植物ウイルス病 / 発症機構 / 葉緑体タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，（1）同調的に退緑・黄化を発症する遺伝子組換え植物の作出とそれら植物の解析，および（2）過敏感細胞死などの抵抗反応に関与する葉緑体タンパク質，THF1の病害応答における役割を解析する．
（1）既報のiTavタバコに加え，CMV Yサテライト由来siRNAの標的遺伝子ChlI，およびモモ潜在モザイクウイロイド由来siRNAの標的遺伝子Hsp90Cを誘導的に発現抑制する形質転換タバコは誘導薬剤依存的に退緑・黄化を発症したが，iTavタバコよりも病害応答遺伝子の誘導が著しかった．この結果は，植物が病原体感染だけでなく，葉緑体障害に対しても病害応答遺伝子の発現誘導を含む，退緑・黄化発症に向けたプログラムを駆動することを示唆する．また，Tavを誘導発現するiTavシロイヌナズナについて，誘導薬剤処理によって再現性良く成長抑制を示す系統について遺伝子発現解析を行い，細胞増殖関連遺伝子の発現の変化，および乾燥や低温に対するストレス応答に関与する遺伝子群の発現誘導が成長抑制に関与することが示唆された．また，同系統において誘導薬剤処理後に下位葉に細胞死が生じることを明らかにした．同系統の種子20000粒から得たM2種子について誘導薬剤存在下で生育可能な突然変異体のスクリーニングを開始した．
（2）以前にTHF1との相互作用を確認したタンパク質のうち，28年度はTIP3について免疫共沈法によって相互作用を確認し，TIP3が低温処理によって誘導されることを明らかにした．TIP3の発現抑制および過剰発現について条件を検討中である．THF1に対する人工マイクロRNA（amiRNA）を同様な誘導プロモーターの制御下で発現する系を構築し，形質転換タバコのT2世代を採種した．この植物を用い，THF1の誘導的発現抑制が誘導薬剤処理後1日で認められること，および明確な退緑・黄化が生じること確認した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに退緑・黄化の分子機構を解析できるモデル実験系としてiTav，および2種類の葉緑体タンパク質，ChlIおよびHSP90Cの誘導型発現抑制系を導入した形質転換タバコ系統群（ami-ChlIおよびhp-HSP90C）を確立し，その基本的性状解析の結果を論文発表した．しかしながら，これらのモデル系におけるプロテオーム解析については，タンパク質の分析条件は最適化できたが，発症組織からの試料調製条件を確定できておらず，29年度の課題となる．
一方，iTavシロイヌナズナについては，使用した誘導発現系における遺伝子発現が確率論的であること，Tavの高発現によって著しい成長抑制が誘導されること，下位葉において細胞死が誘導されること，および細胞周期関連遺伝子の発現解析からG1もしくはG2期において細胞増殖が停止していることが示唆された．また，網羅的な遺伝子発現解析から，低温や乾燥などのストレスに対する応答，およびエチレンおよびアブシジン酸応答経路の活性化が成長抑制に関与することが示唆された．また，変異体スクリーニングにおいて，導入したTav遺伝子発現系の変異体を効率的に除外することのできる方法として，ティッシュプリント法を確立し，すでにこれを活用してスクリーニングを効率化している．
抵抗性タンパク質の相互作用パートナーとして同定したTHF1については，任意のタイミングでTHF1の発現を抑制することの可能な条件的ノックダウン実験系としてami-THF1タバコを確立した．すでにTHF1の相互作用パートナーとして3種類の葉緑体タンパク質，および2種類の細胞質タンパク質を単離しており，ami-THF1タバコを用いることによってそれらの葉緑体タンパク質の発現や機能を解析することが可能になった．
以上のことから本研究は順調に進捗していると判断した．
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| Strategy for Future Research Activity |
光合成系遺伝子発現の低下は，ウイルス病を含む種々の退緑・黄化の発症に共通して起こる変化である．それゆえ本研究課題で作出したモデル実験系を用いて退緑・黄化の分子機構を類型化しようとする場合，プロテオーム変化や活性酸素種生成，葉緑体タンパク質遺伝子発現の変化を解析することによって葉緑体における変化をとらえることが重要である．プロテオーム解析については，タンパク質の分析条件は最適化できたので，発症組織からの試料調製条件を最適化し，iTav，ami-ChlI，hp-HSP90Cおよびami-THF1タバコにおいてプロテオームの比較解析を行う．また，iTavシロイヌナズナだけではなく，iTav，ami-ChlI，hp-HSP90Cおよびami-THF1タバコについてもトランスクリプトーム解析によって葉緑体タンパク質遺伝子発現の変化を明らかにし，その退緑・黄化における意義を考察する．一方，iTavシロイヌナズナに関しては，トランスクリプトーム解析の結果を受けて各種ストレス応答に関する突然変異体との交配個体を作出し，各応答径路の緑化不全および成長抑制への関与を検討する．また，M2種子からTavによる緑化不全や成長抑制を回避する突然変異体をスクリーニングし，野生型iTavシロイヌナズナと交配してF2を取得する．それらのうち，変異体の表現型を示す個体群のDNAをプールして全ゲノムリシークエンスを行うことによって原因遺伝子を同定する．
THF1については，条件的ノックダウン実験系を用いて葉緑体におけるTHF1の機能を明らかにするとともに，細胞質相互作用因子の過剰発現によって葉緑体におけるTHF1蓄積の制御機構について解析する．また，細胞質相互作用因子がどのような環境応答に関与するのかを明らかにし，病害応答だけではなく，非生物的なストレス応答におけるTHF1の関与についても明らかにする．
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| Causes of Carryover |
研究代表者において18243円，研究分担者において511032円の次年度使用額が生じた．前者は本研究に使用するより高額な試薬を学内資金で購入したために生じたものである．一方，後者は平成26年度に予定していた形質転換植物の作出が遅延したために生じたものであり27年度および28年度の使用は予定通りであった．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
研究代表者の次年度使用額は少額であり，次年度の予算と合算して試薬等の購入に充てる．研究分担者の次年度使用額は，形質転換植物の管理・採種のために27年度から雇用している研究補助者の雇用を継続する必要があるため，これに充てる．
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