2015 Fiscal Year Annual Research Report
創薬ターゲットとしてのリガンド作動性陰イオンチャネルに関する研究
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26292031
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| Research Institution | Shimane University |
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Principal Investigator |
尾添 嘉久 島根大学, 生物資源科学部, 教授 (80112118)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
河野 強 鳥取大学, 農学部, 教授 (50270567)
松田 一彦 近畿大学, 農学部, 教授 (00199796)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | イオンチャネル / 創薬ターゲット |
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| Outline of Annual Research Achievements |
GABA作動性塩素イオンチャネル（GABACl）のオルソステリック結合部位に作用する競合的アンタゴニスト候補化合物を合成し、3種昆虫のGABAClに対する高活性アンタゴニストを選抜した。この結果は、GABAClオルソステリック部位が創薬ターゲットとなり得ることを示している。この成果については2報の論文として発表した。昨年度合成したリガンド作動性陰イオンチャネル（LGCC）膜貫通領域を標識するプローブを用いてグルタミン酸作動性塩素イオンチャネル（GluCl）の機能解析を行い、その成果を１報の論文として発表した。
昆虫塩素イオンチャネルで解析が遅れているものの代表としてpH感受性チャネル（pHCl）とヒスタミン作動性チャネル（HisCl）がある。カイコガから単離したpHCl遺伝子をアフリカツメガエル卵細胞に発現させ、機能解析した。バリアントのうちAバリアントについて解析した結果、pH 7.5が半数水素イオン濃度であり、nMのイベルメクチンによって抑制されることが判明した。この成果は論文１報として発表した。イエバエHisClのクローニングと機能解析についても論文発表した。
植物寄生線虫であるネコブセンチュウのアミンおよびアミノ酸作動性塩素イオンチャネルについては、昨年度クローニングしたGABACl(UNC-49B)の機能解析を行い、今年度はさらにUNC-49Cの部分cDNAを取得した。昨年度取得したアミンチャネル遺伝子LGC-55、-53、-40の部分cDNAを鋳型として2本鎖RNA（dsRNA）を合成し、浸漬RNAiを実施した。その際、それぞれのアミンチャネルに対応するアゴニストをRNAi溶液に加えたところ、lgc-53 dsRNA処理によって根への侵入阻害が認められた。アミンチャネルの創薬ターゲットとしての可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の目的は、生物制御剤の重要なターゲットであるLGCCに関する研究を行い、新規生物制御剤創製の基盤を作ることである。これまでに、GABACl、GluCl、および数種のアミン作動性チャネルなど、昆虫や線虫に特異的に発現するLGCCの存在が示された。しかし、これらに対する知見（特に薬理学的知見）は十分得られていない。そこで本研究では次の２点を課題として掲げた。
（１）昆虫から単離したLGCC遺伝子とその変異型の種々リガンドに対する応答と作用点構造の解析。この課題に関しては、GABACl競合的アンタゴニストをデザイン合成し、合成したリガンドの３種昆虫GABAClに対する作用を調べ、構造活性相関にする知見を得た。また、昨年度合成したGluCl光親和性プローブの機能解析を行った。さらに、モデル昆虫であるカイコからpHClを単離し、薬理学的解析を行った。HisClの機能解析も終了した。さらに、LGCCの構造解析に関しては、新規アンタゴニストの作用点を解析するために、GluCl変異体に対する作用を調べ、特異的活性発現メカニズムを明らかにした。ほぼ順調に研究が進んでいる。
（２）動物・植物寄生性線虫に発現するLGCC遺伝子の解析と創薬ターゲットとしての可能性の検証。本課題においては、農作物に大きな被害をもたらすネコブセンチュウに存在するGABAClと数種アミンチャネルの全長および部分cDNAを取得し、GABACl UNC-49Bの機能解析を終了した。さらに、UNC-49C cDNAのクローニングが進行中である。3種アミンチャネルのdsRNAを合成し、そのうちの1種を用いたRNAiによってトマト根への線虫の侵入抑制が認められたことから、創農薬のターゲットとしての重要性が示唆された。研究は、ほぼ計画どおりに進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
上記課題１に関しては、GABAClに感受性を示すアンタゴニストの感受性発現に重要なアミノ酸残基を同定するための実験を行う。Ivermectinの作用機構発現のための電気生理学的解析を行う。糸状菌が産生する殺虫性物質okaramineとchrodrimanin類のGluClアロステリックモジュレーター作用およびGABAClのアンタゴニスト作用について、HEK293細胞に発現させたカイコガGluClに対する[3H]ivermectinの特異的結合とGABAClに対する[3H]EBOBの特異的結合に対する影響を調査し、さらにアロステリック部位の変異による影響を調べることにより糸状菌がつくる殺虫性物質の標的内結合部位を推定する。また、ワモンゴキブリからGluClとGABAClのコード遺伝子をクローニングしたので、両チャネルに対するアンタゴニストの活性を調べる。
上記課題2に関しては、サツマイモネコブセンチュウからUNC-49Cのコード遺伝子全長クローニングを目指す。今年度は、アミンチャネルLGC-55、-53、-40の部分cDNAを用いて浸漬RNAiを実施し、植物根への侵入阻害を指標としてRNAi効果を検証した。来年度は、この侵入阻害がRNAi効果によることを実証するために、RT-qPCRにより標的mRNAの減少を定量する。さらに、LGC-55, -53, -40を同時に標的とするRNAiを実施し、その相乗効果を検証する。また、RACE法を用いてLGC-55、-53、-40をコードする全長cDNAのクローニングを行い、哺乳動物細胞ならびにアフリカツメガエル卵母細胞の発現系を用いた薬理学的解析に資する。
来年度は、本研究の最終年度であるので、昆虫･線虫に発現するLGCCの創農薬ターゲットとしての可能性について総括する。
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