2015 Fiscal Year Annual Research Report
糸状菌MAPキナーゼ経路が制御する細胞壁多糖の生合成を介した細胞接着と性分化
| Project/Area Number |
26292037
|
|---|
| Research Institution | Tohoku University |
|---|
Principal Investigator |
阿部 敬悦 東北大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (50312624)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
矢野 成和 山形大学, 理工学研究科, 助教 (50411228)
佐野 元昭 金沢工業大学, 公私立大学の部局等, 准教授 (80410299)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| Keywords | 糸状菌 / 細胞壁 / 多糖 / 分化 / 形態形成 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、糸状菌のα-1,3-グルカン(AG)が細胞接着を介して菌糸塊形成と有性生殖に関与することを明らかにする。
1. CWI経路, フェロモン経路AG合成酵素遺伝子欠損株の有性生殖能の解析～これ迄に、A. nidulans (高相同組換え株―ligD遺伝子破壊株)を用いて、２種存在するAG合成酵素agsA, agsBの単独破壊株および二重破壊株を用いて造成した。しかし、有性生殖にはLigDが必要であることから各破壊株への野生型ligD遺伝子再導入を行ったが、ligD遺伝子の再導入に手間取り、平成27年度末より有性生殖解析を開始し、継続中である。
2. AgtAの精製と糖転移反応産物の確認～AgtAはGPIアンカーを有する細胞壁局在型のα-gluccosidaseで、α-1,3結合でのglucose転移活性を有し、細胞壁AGの生合成に関与すると考えられる。麹菌AgtAのGPIアンカーを除去した遺伝子を高発現する大腸菌を造成したが活性型を得られなかった。麹菌高発現体の精製tag無しでは精製が出来なかったので、麹菌および酵母でのｔag体の高発に切り替えて発現・精製を継続中である。
3. AGの化学構造と凝集性の解析～麹菌には３種のAG合成酵素(agsA, agsB, agsC)が存在し、三重欠損株を造成した。三重欠損株はA. nidulansと異なり完全分散せず小さな菌塊を形成し、AG以外の凝集因子としてGalactosamino galactan (GAG)の存在が明らかになった。AG三重欠損株にGAG欠損を付加したところ完全分散が初めて達成された。AG三重欠損株は、酵素生産性に優れることが明らかになり、AG-GAG欠損麹菌の酵素生産性も検討中である（特許出願予定）。A. nidulansのAG欠損株でのagsAおよびagsB強制発現のグルカン構造解析は継続中である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1. CWI経路, フェロモン経路AG合成酵素遺伝子欠損株の有性生殖能の解析～2種のAG合成酵素遺伝子単独および二重破壊株へのligD遺伝子の相補に手間取ったが、agsAΔ, agsBΔおよびagsAΔagsBΔ株へのligD相補が完了し、有性生殖解析中である。
2. AgtAの精製と糖転移反応産物の確認～前年度AgtAのGPIアンカーを削ったtag無し変異体を麹菌で高発現し、AgtAの精製したが活性が不安定で解析が出来なかった。現在、GPIアンカーを削ったtag付き変異体の酵母発現株・麹菌発現株を再作製し、急ぎ発現・精製を検討している。
3. AGの化学構造と凝集性の解析～本年度は、麹菌のAG合成酵素三重欠損株(agsAΔagsBΔagsCΔ)を造成し、細胞壁の化学解析から細胞壁AGの完全欠損を確認した。A. nidulans AG合成酵素二重欠損株(gsAΔagsBΔ)が完全分散するのとは異なり、麹菌AG合成酵素三重欠損株は完全分散せず小さな菌塊を形成した。麹菌AG合合成酵素三重欠損株に残る菌糸の凝集性は、Galactosammino-galactan (GAG)由来であることを発見し、AG-GAG欠損株が完全分散することを証明した（特許出願予定）。麹菌AG合成酵素三重欠損株は、酵素生産に優れることを明らかにし論文を投稿した（審査中）。
|
| Strategy for Future Research Activity |
1. CWI経路, フェロモン経路AG合成酵素遺伝子欠損株の有性生殖能の解析～平成27年度末に完成した、A. nidulans agsAΔ-ligD相補株, agsBΔ-ligD相補株, agsAΔagsBΔ-ligD相補株を用いて有性性生殖解析を継続する。
2. AGの化学構造と凝集性の解析
(1)AgsAおよびAgsB単独発現株のAGの化学構造解析～A. nidulans agsAΔagsBΔ二重破壊株にagsAまたはagsBを単独高発現し、その株からAGを精製して、NMRによるアノマー性の確認、メチル化分析による結合様式・分岐度・重合度の化学的解析を行い、AGの化学的性状とAG合成酵素を関連付ける。(2) AgsAおよびAgsB単独発株の精製AGの凝集性評価～DMSOにAGを可溶化後、疎水性蛍光粒子を加え超音波処理でAGを被覆する。粒子がAGで被覆されると粒子表面が親水化し、粒子はDMSO層から水層へ移行する。AG被覆粒子を洗浄後、分散性と凝集性を光散乱計で計測し、AGの凝集性を評価する。(3) AgtAのAG合成への寄与の解析～麹菌agsAΔagsBΔagtA三重破壊株にAgsA-AgtA, AgsB-AgtAを二重高発現した菌体を作出し、細胞壁のAGを精製して構造解析を行う。
3. AgtAの精製と糖転移反応産物の確認～AgtAΔGPIを精製し、AGオリゴ糖を基質として、糖転移反応による産物をLC-MSとNMRにより解析するAgtA高発現株でin vivo合成されるAGの構造解析結果と対応付けて、AgtAのAG合成への寄与と、産物物性を考察する。
|
| Causes of Carryover |
有性生殖試験用菌株の造成の遅れが少しあったことから、解析が次年度にずれ込み、解析費用の使用が減った。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
有性生殖試験菌株が出来あがっているので、前年度の解析の一部が次年度に継続れることになってので、そこで使用予定である。
|
