2014 Fiscal Year Annual Research Report
mRNA fluxの改変による酵母アルコール発酵能とストレス耐性の飛躍的改良
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26292039
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| Research Institution | Kyoto Institute of Technology |
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Principal Investigator |
井沢 真吾 京都工芸繊維大学, 工芸科学研究科, 准教授 (10273517)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
杉山 峰崇 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (80379130)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | バニリン / 翻訳抑制 / リグノセルロース / バイオマス / バイオエタノール / アルコール発酵 / 酵母 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
バニリン存在下でもポリソームで優先的に翻訳されるmRNA種の同定
木質・草本系バイオマス由来発酵阻害物質のうちバニリンは最も発酵阻害効果が高く、10 mM前後で翻訳活性を著しく低下させcytoplasmic mRNP granuleの形成を誘導する(Iwaki et al., PLoS One, 2013)。そのため、大部分のmRNAは翻訳されずP-bodyやstress granuleといったcytoplasmic mRNP granuleに隔離されるが、一部のmRNAはバニリン存在下でもポリソームで翻訳されることが確認されている。バニリンストレス下でも優先的に合成される翻訳産物がバニリン耐性獲得において極めて重要な役割を担っていると考えられることから、ストレス下でもポリソームに含まれ翻訳されるmRNAの同定をおこなった。
ポリソーム画分からmRNAを回収し、DNAマイクロアレイによって遺伝子を同定した。同定したそれぞれの遺伝子について、qRT-PCRおよびWestern blot解析を行い、バニリンストレス下でもスムーズに転写・翻訳される遺伝子（VEP遺伝子）を複数同定することに成功した。
さらに、同定した遺伝子のプロモーター領域およびターミネーター領域の遺伝子配列を用いて、任意の遺伝子の発現がバニリンストレス下でも可能になるのか検討を行った。これまでに、VEP1遺伝子のプロモーター領域およびターミネーター領域を用いることで、GFPなどのnon-nativeな遺伝子をバニリンストレス下で発現させることに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
10mMのバニリン存在下で翻訳活性が抑制された状態の出芽酵母細胞から、ポリソーム画分を抽出し、さらにポリソーム画分に含まれるmRNAの回収をおこなった。DNA マイクロアレイによって、非ストレス条件下のポリソーム画分から回収したmRNAとの比較をおこない、バニリン存在下でもポリソームを形成するmRNA種を同定した。これらのmRNAはVEP1-25と命名した。VEP1-3について、各種濃度のバニリンストレス下での転写レベルや翻訳レベルを検討し、高濃度バニリンストレス存在下でも翻訳・発現することを確認した。また、VEP1遺伝子のプロモーター領域およびターミネーター領域を用いることで、GFPやGPX2などのnon-nativeな遺伝子をバニリンストレス下で発現させることに成功した。VEP2およびVEP3遺伝子のプロモーター領域およびターミネーター領域を用いても、同様の結果を得た。また、バニリン同様にバイオマス由来の発酵阻害物質であるフルフラールやヒドロキシメチルフルフラールなどによっても、VEP2やVEP3の発現が抑制されず、優先的に翻訳されていることを見出した。
また、VEP1/2/3の遺伝子破壊株について、バニリン感受性を検討したところ、VEP1欠損株は高濃度のバニリンに対して高い感受性を示すことが確認され、VEP1が高濃度バニリンへの適応において重要な役割を果たすことが示唆された。一方、VEP2の欠損株は比較的低濃度のバニリンストレスに対しても高い感受性を示したことから、バニリンの無毒化や適応において重要な役割を担うと考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
同定したVEP1-3遺伝子のプロモーター領域とターミネーター領域を用いて、バニリン存在下でも任意の遺伝子の発現を実現することが可能となった。そこで、VEP1-3の中から発現効率の良いプロモーター領域とターミネーター領域の組み合わせを検討し、バニリンストレス下での遺伝子発現に最適化した発現用ベクターを新たに構築する。なお、非翻訳領域の利用のみで解決できない場合には、翻訳の開始に重要なKozak配列をはじめ開始コドン近傍の塩基配列やOpen reading frame (ORF)内の配列(特に開始コドンのすぐ下流の配列)などが輸送・翻訳効率に影響する可能性を検討し、改良を加える。
また、バニリンストレス下でも優先的に翻訳されるmRNA群は、バニリンストレス応答に特化した翻訳および核外輸送制御機構を共有している可能性が考えられる。そこで、これらのmRNAの非翻訳領域に共通する特徴的な塩基配列モチーフや結合タンパク質が存在するのか検討する。
バニリン耐性獲得において重要だと思われるVEP1-3遺伝子について、多コピーベクターに導入して過剰発現株を構築し、バニリンに対する耐性が改善されるか検討する。 単一遺伝子の過剰発現では、バニリン耐性を効果的に付与できないことも予想されることから、同定した遺伝子の細胞内機能を考慮しつつ、多重で過剰発現させて最も高いバニリン耐性を付与する遺伝子の組み合わせを検討する。バニリン耐性が改善された遺伝子については、実用酵母でも過剰発現株を構築し、バニリン耐性となることを検証する。その後、バニリン含有培地を用いたバイオエタノール製造において、生産効率の飛躍的向上が可能か検証する。
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| Causes of Carryover |
当初購入予定であった分析機器を他財源で前倒しで入手することができたため差額が生じた。また、キャンペーン商品の購入などによって節約に努めたため、翌年に繰り越すことが可能となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
研究のさらなる効率的推進をはかるため、高効率試薬類などの購入を予定している。
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