2015 Fiscal Year Annual Research Report
異常アミノ酸形成酵素の構造解析、機能改変、ペプチド工学への応用
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26292040
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
園元 謙二 九州大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (10154717)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
神田 大輔 九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (80186618)
善藤 威史 九州大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (50380556)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ランチビオティック / 翻訳後修飾 / nukacin ISK-1 / 異常アミノ酸形成酵素NukM / リーダーペプチド / ペプチドの機能改変 / 脱水・環化 / 抗菌ペプチド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、Staphylococcus warneri ISK-1が生産する抗菌ペプチドnukacin ISK-1を研究対象とした。Nukacin ISK-1は始めにN末端にリーダーペプチド、C末端側にプロペプチドをもつ前駆体NukAとしてリボソーム上で合成される。その後、NukAは異常アミノ酸形成酵素NukMにより4ヶ所のセリン、トレオニン残基が脱水され、このうち3ヶ所が分子内のシステイン残基と環化することで、異常アミノ酸が導入される。
NukMをN末端（NukMN; 1-577 a.a.）とC末端（NukMC; 578-917 a.a.）に分離し、各領域の機能解析を行った結果、NukMのN末端領域が基質認識ドメインとして機能し、NukAのリーダーペプチドを認識する事が示された。この結果を基にNukMのN末端にNukAリーダーペプチド（LP）を融合した人工改変His-LP-NukMを大腸菌で発現させ精製した。His-LP-NukMを用いてリーダーペプチドがないNukAと反応させ、質量分析を用いて修飾活性評価を行った。さらにNukAと異なるペプチドへの異常アミノ酸導入を試みた。NukAの1－10残基のC末端に14アミノ酸からなる直鎖状抗菌ペプチドを融合し、さらに抗菌ペプチドのC末端側にシステインを付加した基質（NukA-抗菌ペプチド複合基質）を合成し、His-LP-NukMによる修飾活性評価を行った。
リーダーペプチドのないNukAはHis-NukMでは修飾が確認されなかったが、His-LP-NukMでは不完全ながらも4脱水2環化の修飾が確認できた。さらにNukA-抗菌ペプチド複合基質とHis-LP-NukMの反応の結果、1脱水1環化の反応物が生じ、間接的であるがランチオニン環の導入によりNukAと相同性のない直鎖状抗菌ペプチドの環状化に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画書の作成段階で、予想される問題点を明確にしていたことと、数値目標を定め多方面からの検討を柔軟に行ったことが順調に進展する結果となった。また、研究代表者と分担者が互いの専門領域で柔軟に対処したことも大きな要因と言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
強化型ランチビオティックの創成：lipid II高親和性となるnukacinのデザインについて取り組む。すなわち、Nukacin ISK-1-lipid II複合体構造情報をさらに詳細に得るために、nukacin ISK-1に対して界面活性剤n-octyl-β-D-glucoside（βOG）とlipidⅡの二段階滴定を行い、NMRを用いてnukacin ISK-1の1H-15N 二次元相関スペクトルの測定を行う。そこで得られたnukacin ISK-1各残基の化学シフト変化から、nukacin ISK-1のlipidⅡとの相互作用領域を推定する。また、より簡便にlipidⅡと相互作用をするnukacin ISK-1のアミノ酸を決定するために、Bacillus subtilisの2成分制御システム、LiaRSが利用できるかについても調べる。LiaRSはlipidⅡと特異的に作用する抗生物質の簡便な検索システムである。このような情報を基にして、最終的にLipid II高親和性のnukacin改変体のデザインを目指す。
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| Causes of Carryover |
相乗り分析のため試薬等が減少した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度に計画している、核磁気共鳴（NMR）解析に必要なnukacin ISK-1の精製物や細胞壁前駆体リピドIIの合成物の調製に使用する。
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