2014 Fiscal Year Annual Research Report
基幹Ｃ４化合物の発酵生産プロセス開発のための基盤研究
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26292042
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
片岡 道彦 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 教授 (90252494)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 微生物 / 応用微生物 / 酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、高機能性ポリマーの原料として利用価値の高い基幹Ｃ４化合物を、グルコース等のバイオマス資源から効率的に発酵生産するプロセスの構築を目指している。そのために設計した基幹Ｃ４化合物生合成経路を付与構築した遺伝子組換え微生物を分子育種するとともに、構造生物学的・進化分子工学的手法を用いた生合成経路内酵素群の最適化、発酵生産条件の検討、宿主菌株の改良等を進めている。
（１）基幹Ｃ４化合物生産のために設計した生合成経路の中で鍵となる反応を触媒するNADH要求型アルデヒド脱水素酵素に関して、高活性型の変異酵素を探索・創出することを試みた。大腸菌に対して遺伝子破壊を行い、NADH消費が抑制され細胞内の酸化還元バランスが崩れることで、生育抑制が見られる変異株を取得した。この変異株を宿主として、基幹Ｃ４化合物生合成経路を司る酵素遺伝子（アルデヒド脱水素酵素遺伝子を除く）を導入するとともに、ランダム変異処理を行ったアルデヒド脱水素酵素遺伝子を導入することで、NADH消費が上昇し生育が回復した株を探索した。その中から、高活性型の変異アルデヒド脱水素酵素の取得を試み、いくつかの有望株が見出されたが、現在までのところ優位な活性上昇は認められなかった。
（２）基幹Ｃ４化合物生合成経路上の酵素について、大腸菌内での異種発現効率を高め酵素活性を強めるために、３種の酵素遺伝子の使用コドンを大腸菌の発現系に最適化した。
（３）宿主菌として想定している大腸菌において、基幹Ｃ４化合物の生合成経路内中間生成物の分解・代謝に関与するおそれのある酵素がいくつか存在している。これらの酵素遺伝子を単独または複数破壊した株を作成した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
以下の研究進展の現状から判断した。（１）現在のところ、高活性型の変異アルデヒド脱水素酵素は得られていないが、スクリーニング系が確立できていることから、さらなる探索により取得できる見込みである。（２）大腸菌内での異種遺伝子発現の効率化を進められた。（３）中間生成物の分解・代謝経路を複数選択し、それらの遺伝子について単独あるいは複数の遺伝子破壊株を取得することに成功している。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成26年度に得られた結果を基にして引き続き、（１）基幹Ｃ４化合物生産に適したアルデヒド脱水素酵素の探索・創出、（２）基幹Ｃ４化合物生合成酵素系の最適化、（３）宿主菌の代謝改変、に関してさらなる検討を進める。
（１）に関しては、収集した候補酵素の評価・選別を行う。選別した酵素を親酵素として進化分子工学的手法やタンパク質工学的手法を用いた改良を繰り返し行い、高機能型酵素の創出へ向けた検討を進める。
（２）に関しては、経路内酵素について現状で発現や活性が確認できているものに関しても、本反応に適した性質を有する酵素の探索と適用を適宜試して評価していく。特に、各酵素遺伝子の宿主菌株への導入方法やプロモーターの検討などを通して各酵素反応の力価調節を行う。
（３）に関しては、基幹Ｃ４化合物中間生成の分解・代謝に関わる酵素遺伝子だけでなく、宿主菌株におけるその他の副産物生合成に関わる酵素遺伝子の同定と破壊を試みる。
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| Causes of Carryover |
今年度は、主に研究の円滑な立ち上げに主眼を置き、これまでの先行研究をベースとした検討を進めてきたが、必要な試薬の在庫が予想以上にあったため、試薬購入費用が抑えられた。また、研究補助員を雇用する予定であったが、多数の大学院生が本研究に従事したため、雇用の必要がなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
前年度未使用額と合わせて、計画的に使用する予定であり、今後の研究の展開によって必要となる高額機器の購入も検討している。
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