2014 Fiscal Year Annual Research Report
EF-ハンド蛋白質ALG-2の核内および生体膜におけるカルシウム応答反応制御機構
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26292050
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
牧 正敏 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (40183610)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柴田 秀樹 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (30314470)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | カルシウム結合タンパク質 / EF-ハンド / 結合モチーフ / Ｘ線結晶構造解析 / 疎水性ポケット / 相互作用 / 小胞輸送 / 小胞体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は、５つのEF-ハンド（ヘリックス-ループ-ヘリックス型Ca2+-結合モチーフ）をもつALG-2が二量体を形成し、相互作用因子同士を連結させるCa2+依存的アダプター機能をもつこと、そして、相互作用因子のALG-2結合モチーフが2種類に大別されることを明らかにしてきた。本研究は、動物細胞内において核内ならびに内膜系におけるALG-2依存的カルシウム応答制御機構に焦点をあて、ALG-2と新規相互作用因子が果たす役割を分子レベルで明らかにすることを目的としている。
小胞体（ER）からゴルジ体に輸送されるタンパク質は、ER膜上の特定の部位からCOPII小胞が出芽するが、COPII小胞外殻タンパク質複合体の構成成分Sec31AはALG-2のアダプター機能によってER膜上のannexin A11と結合することが明らかになった。一方、Sec31AペプチドとALG-2のＸ線結晶構造解析および変異体解析により分子認識機構を明らかにした。そして結合配列を精査することにより新たな結合モチーフを提唱した。そしてこのようなモチーフの条件を満たす膜貫通あるいは核内タンパク質を含む10以上のタンパク質をデータベースより抽出し、cDNA断片を緑色蛍光タンパク質発現ベクターに挿入し、動物細胞で発現させ、ALG-2との相互作用を共免疫沈降およびファーウェスタン解析を行った結果、いくつかの陽性クローンが得られた。一部のものについては、全長クローンを取得し、共焦点レーザー顕微鏡による細胞内局在解析を行った。内在性タンパク質を認識するとされる市販抗体は感度が悪く、本研究に供することができなかったため、今後は特異性の高い抗体を自前で取得することが必要である。結合モチーフをもつにもかかわらず、ALG-2との結合が検出されないクローンも存在したため、モチーフをさらに精査する必要がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
COPII小胞外殻構成因子であるSec31AペプチドとALG-2複合体のＸ線結晶構造の精密化を行い、また変異体解析により結合モチーフの精査を行った。この結果は学術専門雑誌に投稿し、受理され既に公開された。本研究ではこの精査した結合モチーフをもとに、新たなデータベース検索により得られた候補の発現産物のALG-2結合能解析を行い、新規相互作用蛋白質候補を５つに絞ることまで進んだ。これらの因子の幾つかは膜貫通領域をもっており、オルガネラ膜を貫通した状態で機能すると考えられ、今後の細胞内局在解析と機能解析に価値ある知見が得られた。しかし、結合モチーフをもつにもかかわらず、ALG-2との結合が検出されないクローンも存在したため、モチーフをさらに精査する必要性が生じた。また、研究分担者はSec31AがアネキシンA11とALG-2を介して結合するが、アネキシンA11とALG-2ともにER-Golgi輸送制御に関わっていることをモデル積荷タンパク質の細胞生物学的、生化学的解析により明らかにし、学術専門雑誌に掲載した。
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| Strategy for Future Research Activity |
新規相互作用蛋白質候補であるSARAFは市販の抗体は感度が悪く、ウェスタンブロット解析や、免疫沈降、免疫染色に適用できないことが判明した。人為的に過剰発現させたものではなく、細胞内に存在している当該蛋白質の動態を調べるためには、特異性の高い抗体の取得が必要であり、自前で抗体を調製することにした。このためには、組換え体蛋白質の取得が必要であり、発現ベクターの構築から行なわねばならないが、予備実験で行ったところ、発現量が極めて低く、大腸菌内で分解されやすいか、毒性があると思われる。このため、種々発現断片を作製しベクターとの組み合わせなど試行錯誤が必要である。ペプチド抗体の作製も一つの選択肢であるが、市販の抗体がペプチド抗体で購入した標品が使用に耐えないことを考えると、やはり大腸菌で組換え体を作製することが肝心と思われる。
ALG-2結合モチーフをもつにも関わらず結合活性を解析した結果、相互作用しない蛋白質も多く存在した。2014年度は結合モチーフを有する蛋白質200余りのうち、13を試したに過ぎない。結合するものとしないものの間にはどのような規則が存在するのか、これを明らかにすることにより、さらに新規相互作用因子探索効率を上げることができると考えられる。
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| Causes of Carryover |
設定したALG-2結合モチーフをもつにも関わらず結合しないクローンも多く存在したため、ALG-2結合モチーフを再度精査する必要が生じ、陽性クローンの機能解析までは進むことができなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
ALG-2結合解析はこれまで免疫ブロット法およびFar Western法によっていたが、定量性に欠ける問題点があった。このため、高発光型低分子量リシフェラーゼを用いた結合方法を確立するための試薬一式を購入する。ルシフェラーゼとALG-2の融合蛋白質を発現させ、標的蛋白質の免疫沈降産物のルシフェラーゼ活性を測定する。測定機器としてﾏﾙﾁﾓｰﾄﾞﾌﾟﾚｰﾄﾘｰﾀﾞｰは平成26年度に購入し、また、別途に予備実験用のルミノメーターは研究室に既にそなわっている。
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Research Products
(13 results)
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[Journal Article] Structural analysis of the complex between penta-EF-hand ALG-2 protein and Sec31A peptide reveals a novel target recognition mechanism of ALG-2.2015
Author(s)
Takahashi T, Kojima K, Zhang W, Sasaki K, Ito M, Suzuki H, Kawasaki M, Wakatsuki S, Takahara T, Shibata H, Maki M
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Journal Title
Int J Mol Sci
Volume: 16
Pages: 3677-3699
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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