2015 Fiscal Year Annual Research Report
分裂酵母のピルビン酸転移酵素変異体を用いた新奇糖鎖の酵素合成と糖鎖工学への応用
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26292054
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
竹川 薫 九州大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (50197282)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 酸性糖鎖 / ピルビン酸含有糖鎖 / シアル酸 / 糖タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、分裂酵母糖鎖の末端にピルビン酸を付加する酵素であるPvg1を用いて、新たなピルビン酸含有糖鎖の酵素合成を試みることを目的としている。これまでの研究で、Pvg1はヒト複合型糖鎖の末端に糖鎖を付加することは出来ないが、Pvg1タンパク質の立体構造解析により、基質特異性の改変に成功してピルビン酸含有複合型糖鎖の合成が可能となった。今年度は明らかにしたPvg1タンパク質の構造から点変異体を作成することで、酵素の触媒活性に重要なアミノ酸の同定を行うことができた。ピルビン酸が付加されたヒト複合型糖鎖を効率良く糖タンパク質へ転移させるために、ヒト複合型糖鎖に作用して糖鎖を遊離できるエンドグリコシダーゼをキノコ類のゲノムから見いだし、本酵素変異体が高い糖鎖転移活性を持っていることを証明した。さらに本酵素変異体の諸性質について明らかにすることができた。Pvg1を用いてパラニトロフェニル化ピルビン酸ガラクトース(pNP-PvGal)の合成を行い、本化合物を用いてピルビン酸化ガラクトースを分解する新奇酵素の探索を行なった。その結果、土壌より単離したBacillus属細菌の培養液が、pNP-PvGalを分解する活性を持つことを見出した。本菌の全ゲノム塩基配列を高速シーケンサーにより解読し、候補遺伝子について大腸菌での発現・生産により同定を試みた。候補遺伝子の中でGH2ファミリーに属するグリコシダーゼがpNP-PvGalからPvGalを遊離することが出来ることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
・ピルビン酸含有複合型糖鎖については、Pvg1変異体により数ミリグラムの糖鎖を調製することができたため、糖鎖アレイ解析によりヒトに普遍的に見られるα2,6-結合したシアル酸と類似した特性をもつことを明らかにできた点は大変興味深い。
・ピルビン酸含有糖鎖をタンパク質へ転移可能な新たなエンドグリコシダーゼをキノコ類の中から選別できたこと。さらに本酵素により効率良くピルビン酸含有糖タンパク質の合成が可能になったことは当初予想していたよりも新たな成果を得ることができた。
・これまで誰も合成していなかったパラニトロフェニル化ピルビン酸ガラクトースをPvg1により酵素合成できたこと、また本酵素を用いて土壌微生物から新たなグリコシダーゼを発見することができたのは予期していない新たな成果である。
以上の点から当初の研究計画はおおむね順調に進展しており、さらに本研究により当初の予想以上に新たな進展もあった。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は最終年度であり、ピルビン酸化含有糖鎖をもったタンパク質がヒトなどの高等動物で、どのような動態を示すかについて解析を行いたい。具体的には、Pvg1変異体により酵素合成したピルビン酸含有複合型糖ペプチドと、キノコ由来エンドグリコシダーゼの糖鎖転移活性を利用して、ピルビン酸含有糖鎖を持ったヒトトランスフェリンを合成する。得られたトランスフェリンをマウス静脈内に投与して、その個体内での挙動について解析を行いたい。また通常のシアル酸含有糖鎖をもったトランスフェリンと、その血液内での安定性について比較検討を行う予定である。
本研究で得られたBacillus属細菌からの新奇ピルビン酸化ガラクトース分解酵素については、本酵素の立体構造解析を行いたい。得られた酵素の立体構造から、なぜ本酵素が新たな基質特異性を有しているのかについて、明らかにしたいと考えている。
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| Causes of Carryover |
昨年度の夏にこれまで使用してきた超低温フリーザーが故障して保存菌株の保存に支障をきたした。そこで消耗品を節約して超低温フリーザーの購入用に予定していたが、９月以降気温が低下したところ、一時的に正常に作動するようになった。そのため次年度に購入を予定するために翌年度分として持ち越すことにした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度は夏前に超低温フリーザーを購入予定である。
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