2015 Fiscal Year Annual Research Report
呼吸鎖複合体-Iの１分子計測を実現する特異的化学修飾法の確立
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26292060
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
三芳 秀人 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (20190829)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 生物制御化学 / ミトコンドリア / 呼吸鎖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ミトコンドリア複合体-Iの動きを可視化するために、可視化プローブによって酵素を位置特異的に標識することが必須である。複合体-Iの位置特異的化学修飾を達成するために、本研究ではLDTケミストリーの手法を取ることにした。LDTケミストリーに利用可能なリガンド分子として、アセトゲニンを鋳型にしたプローブ分子を設計・合成した。
合成したアセトゲニンリガンドを用いて、ウシ心筋ミトコンドリア複合体-Iに対して位置特異的にアジド化とアルキン化を試みた。電気泳動、精密質量分析などの一連のタンパク質（ペプチド）化学分析の結果、キノン結合ポケットを構成すると考えられている49 kDaサブユニットのAsp160（49 kDa Asp160）を特異的に化学修飾していることが明らかになった。この化学修飾は、短鎖キノンや他の阻害剤の共存によって完全に抑制された。この結果は、この修飾が特異的なものであることを保証するものである。修飾率は約50％であり、修飾された酵素はほぼ完全に失活することがわかった。
49 kDa Asp160に置換したアジド基に対して、種々の環状アルキン（大きな環ひずみを有するもの）の反応性をインタクトな複合体-Iを用いて精査したところ、嵩高い環状アルキンであっても49 kDa Asp160-N3と直接的に反応することが明らかになった。この事実は、49 kDa Asp160-N3を足場として、さらに多様な合成分子を置換することが可能であることを示唆するものである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
複合体-Iのキノン結合ポケットを構成する49 kDaサブユニットのAsp160（49 kDa Asp160）を特異的に化学修飾することができたことから、これを足場にしてさらに多様な化学修飾を展開できる可能姓が見えてきた。
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| Strategy for Future Research Activity |
49 kDa Asp160-N3に対して、どの程度まで嵩高い分子が反応（クリックケミストリー）できるかを早急に見定める必要がある。
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| Causes of Carryover |
アセトゲニンプローブ分子の実際の合成が計画通りに進まなかったため、使用する消耗品（合成試薬、有機溶媒）が計画を下回ったためである。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
27年度の終盤（28年2～3月）になって、アセトゲニンプローブ分子の合成上の問題点がある程度解決できたため、28年度は計画通りに使用できる見通しである。
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