2014 Fiscal Year Annual Research Report
野生水禽や家禽におけるマレック病ウイルスの病原性進化の分子機序の解明
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26292147
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
大橋 和彦 北海道大学, (連合)獣医学研究科, 教授 (90250498)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
村田 史郎 北海道大学, (連合)獣医学研究科, 助教 (10579163)
今内 覚 北海道大学, (連合)獣医学研究科, 准教授 (40396304)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | マレック病 / マレック病ウイルス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マレック病ウイルス（MDV）は、ワクチンにより制御されているが、近年、ワクチン接種鶏でのマレック病発生や野生水禽での強毒MDV感染が報告されており、野外でのMDVの病原性進化が示唆されている。そこで、近年日本国内の養鶏や野生水禽から検出されたMDVの分子生物学的性状を従来の分離株と比較して、同定されたMDVの遺伝子多型や欠損のMDV病原性進化のおける役割を明らかにするために、組換え感染性MDVクローンを作成し、鶏を用いた感染実験等で解析する。
本年度は、日本各地のワクチンブレーク鶏から、国内で流行しているMDV株の分離を行った。マレック病（MD）を発症したワクチン接種鶏由来の血液材料等を用いて、細胞培養やMD感受性鶏での継代でワクチン株を除去した国内MDV株を単離した。そしてMDV発癌遺伝子であるmeq遺伝子配列を、米国で報告されている強毒MDV株のものと比較したところ、meq遺伝子産物の生物活性に重要なドメインに多型が検出されたが、従来の強毒株とは異なるものであった。今後、実験感染による病原性の検討が必要である。他にも日本各地で採取したMD発症鶏材料で検出したMDVのmeq遺伝子配列を決定したが、やはり従来の強毒株のものとは異なっていた。以上より国内でワクチンブレークを引き起こすMDV株は、米国の強毒MDV株とは異なる性状を持つことが示唆された。
近年、種々の腫瘍や難治性慢性感染症において免疫抑制因子PD-1/PD-L経路が免疫回避に重要であることが報告されているので、MD腫瘍においてもPD-1/PD-L経路による免疫回避が病態形成に関与しているかを検討した。その結果、MD腫瘍ではPD-L2が多く発現しており、T細胞に発現しているPD-1を介して免疫抑制を引き起こすことが示唆された。今後、MDVの病原性進化と免疫抑制因子を介した免疫回避との関連を検討する必要がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ワクチンブレーク鶏からワクチン株を除外して、強毒MDV株を単離することは、MDVが細胞随伴性であるため困難である。しかし本年度、ワクチンブレーク鶏から国内で流行していると考えられるMDV株の単離に成功したため、今後、遺伝子レベルではなく、ウイルスの生物学的性状を感染実験等で解析できるので、国内におけるMDVの病原性進化の機序を明らかにする上で非常に有用な材料を確立できた。また分離MDVの感染性クローンの作成の開始しており、より多面的な解析が可能となる。また本年度の解析によりMDVの病原性進化と免疫抑制との関連が示唆され、今後の解析でMDV病態形成における免疫抑制の役割が解明されることが期待される。以上より、初年度としては、大きな成果を挙げたと判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
MDVの病原性進化に伴うMDVゲノムの遺伝子変化・多型の同定およびそれらの役割を解析するために、前年度から継続して、野生水禽やワクチンブレーク鶏由来MDV株特異的変異を導入した組換えMDV感染性クローンを作製して、MD感受性鶏を用いた感染実験により、その生物学的性状・病原性を親クローンと比較する。また複数の変異がワクチンブレークに関与していることも予想されるので複数の薬剤耐性マーカーを用いて変異領域と連結した合成遺伝子を作製して、複製の変異を導入した組換えMDV感染性クローンを作製しての解析も検討する。
強毒MDVによるワクチンブレークには、ウイルス側の因子のみならず、宿主側の因子も関わっていることが考えられるが、PD-1/PD-L経路のみならず、マイクロアレイ解析によりワクチンブレークなどMDVの病原性進化に伴う、その他の標的宿主遺伝子群の同定を行う。野生水禽やワクチンブレーク鶏から分離したMDV株とリフェレンス株、あるいは前年度から作製しているワクチンブレーク特異的変異を導入した組換えMDV感染性クローンおよびその親クローンをそれぞれ、培養鶏細胞株に導入し、培養後導入細胞からRNA検体を抽出してこれをプローブとしてマイクロアレイ解析を行い、ワクチンブレーク特異的に発現増強（あるいは抑制）する宿主遺伝子群を同定する。またMDVによる潜伏感染とその後の腫瘍化における病原性変化を解析するため、細網内皮症ウイルスで形質転換した鶏CD4+T細胞株にも組換えMDVクローンを導入して同様にアレイ解析を行う。
以上の解析を実施して、MDVの病原性進化に伴うウイルス側の因子およびMDVの病態形成に関与する宿主側因子のより詳細な解析を行う。
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| Causes of Carryover |
当初、ワクチンブレークMDV株を分離するために、大規模細胞培養やMD感受性鶏を用いた継代を数代以上計画していたが、予想よりも非常に少ない継代で単離に成功したため、研究補助雇用、実験動物施設使用料、培養機器等の消耗品費、実験動物購入費などが未使用となった。また分離に成功したワクチンブレークMDV株の感染性クローンの作成を現在実施しているが、より詳細な解析のために、多くの変異導入株を作成およびリファレンス株としてワクチン株であるHVTの感染性クローンも作成することとして、次年度以降の消耗品購入費、実験動物施設使用料に使用することとした。また小型恒温恒湿器を購入予定であったが、現有機器で代替できることが判明し、購入を中止しため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
理由の項に記載したとおり、今年度、分離に成功したワクチンブレークMDV株の感染性クローンの作成し、さらにより詳細な解析のために、多くの変異導入株を作成すること、およびリファレンス株としてワクチン株であるHVTの感染性クローンも作成することとして、消耗品購入費、実験動物施設使用料に使用する。また分離ワクチンブレークMDV株の全ゲノム解析を次世代シークエンサーを用いて行うため、必要な試薬、キット等に使用する。
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[Journal Article] Expression of PD-L1 on canine tumor cells and enhancement of IFN-γ production from tumor-infiltrating cells by PD-L1 blockade.2014
Author(s)
Maekawa N., Konnai S., Ikebuchi R., Okagawa T., Adachi M., Takagi S., Kagawa Y., Nakajima C., Suzuki Y., Murata S., Ohashi K.
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Journal Title
PLoS One
Volume: 9
Pages: e98415
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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