2015 Fiscal Year Annual Research Report
マクロファージ－筋線維芽細胞を基軸とした難治性線維化の臓器横断的発生機序の解明
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26292152
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
山手 丈至 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 教授 (50150115)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹中 重雄 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 准教授 (10280067)
桑村 充 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 准教授 (20244668)
井澤 武史 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 准教授 (20580369)
秋吉 秀保 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 准教授 (50420740)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 病理学 / 線維化 / マクロファージ / 筋線維芽細胞 / 難治性疾患 / 臓器横断的解析 / 腎線維化 / 肝線維化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
未だ治療法が確立されていない難治性線維化の発生機序をマクロファージ-筋線維芽細胞の相互関連（M-M axis）の特性に基づき、臓器毎に生じる線維化（特に、腎線維化、肝線維化/肝硬変、膵線維化、心筋線維化）の発生機序を臓器横断的に比較解析し、難治性線維化の新たな治療法を探索する。今年度は、チオアセトアミドを35週間週2回投与することで誘発された肝硬変の多様な病態をマクロファージのM1/M2分極化の観点から解析した。このモデルでは15週以降に線維性架橋による偽小葉の形成が始まり、それはヒトの小結節性肝硬変に類似することを示した。偽小葉と線維性架橋と、胎盤型グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST-P)発現（前腫瘍性病変）と非発現の偽小葉とを、それぞれに対象部位と比較したところ、線維性架橋とGST-P陽性偽小葉において、より多くのM1/M2マクロファージが出現することを明らかにした。かつ、M1型(INF-γ、TNF-α、IL-6)とM2型（IL-4, TGF-β）関連因子も連動して増加していることが分かった。さらに、この肝硬変モデルを用いて、肝前駆細胞の特性を筋線維芽細胞との関連で解析した。その結果、肝前駆細胞は、線維性架橋に出現し、GFAP（肝星細胞マーカー）とCK19（胆管上皮マーカー）を共発現することが分かった。すなわち、肝前駆細胞が上皮系と間葉系（筋線維芽細胞）への二つの方向性に分化することが示された。肝前駆細胞から生じた異常な胆管（偽胆管）は上皮－間葉転換（EMT）を介して筋線維芽細胞を転換するとされるが、偽胆管上皮には免疫組織学的解析においてEMT現象はみられなかった。すなわち、肝硬変の線維化部位に出現する筋線維芽細胞は、肝星細胞の前駆細胞に由来することが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年度には、腎線維化と肝線維化の急性モデルを作製し、線維化に係るマクロファージと筋線維芽細胞の特性を明らかにすることができた。ほぼ予定通り進んでいる。さらに、今年度は慢性肝線維化モデル（肝硬変）を作製し、出現するマクロファージの機能特性と筋線維芽細胞の由来を明らかにすることができた。腎線維化での急性と慢性病変に出現するマクロファージの特性解析の一部と、心筋線維化と膵線維化モデルの作製と解析を、次年度に積み残していることから、総じて「概ね順調に進展している」と判断する
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| Strategy for Future Research Activity |
線維化に係るマクロファージと筋線維芽細胞の相互の関連(M-M axis)をさらに追究するために、１）腎線維化と２）肝線維化に出現するマクロファージと筋線維芽細胞の特性と、３）その他の臓器として心筋と膵臓の線維化、さらに４）犬・猫の線維化病変について解析を加える。
１）腎線維化モデル：ラットに腎傷害を誘発するシスプラチンを投与し、作製した急性と慢性のモデルを用いて、M1/M2マクロファージ分極化の観点から病態を解析する。M1はCD68を、M2はCD163に対する免疫染色で区別する。また、マクロファージを認識するMHCクラスII、CD204、Iba1、ガレクチン-3などを用いて、これらを発現するマクロファージの分極化を二重蛍光免疫染色で解析する。さらに、傷害された尿細管上皮の上皮‐間葉（筋線維芽細胞）転換（EMT）を解明するために、α-平滑筋アクチンのみならず、デスミンやビメンチン等で評価するとともに、上皮系のマーカーとしてE-カドヘリンやN-カドヘリンを用いて、EMTの推移を解析する。また、EMTに係るWntシグナルを評価するためにβ‐カテニンの動態（細胞膜から核移行）を免疫組織化学的に評価する。２）肝線維化でのマクロファージ枯渇モデル：ラットに肝毒性を有するチオアセトアミドを投与することで作製したラットの急性モデルに、マクロファージを枯渇させるクロドロネートリポソームを投与し、出現するマクロファージと筋線維芽細胞をM-M axisの特性に焦点を当て、解析する。３）心筋線維化と膵線維化：心筋線維化はイソプレテレノールを用いて、膵線維化はDibutyltin Dichlorideを用いて作製し、その基本的な組織像を明らかにする。また、腎線維化や肝線維化と同様にM-M axisの特性を解析する。４）犬・猫の線維化病変：膵線維化や心筋線維化病変を継続的に収集し、筋線維芽細胞の特性を中心に解析する。
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| Causes of Carryover |
シスプラチン誘発腎線維化とチオアセトアミド誘発肝線維化のモデル動物の作製は順調に進み、出現するマクロファージと筋線維芽細胞の特性解析については新たな知見を得つつある。しかし、イソプロテレノール誘発心筋線維化モデルとDibutyltin Dichloride誘導膵線維化については、予備実験は行ったがまだ適切なモデルが確立できていない。さらに、肝線維化の急性モデルを用いて、マクロファージの枯渇実験と内毒素LPSによるマクロファージ活性実験を検討している。このような多くの動物実験を必要とすることや、免疫染色解析用の抗体試薬等が高額である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
動物実験としては、シスプラチン誘発腎線維化とチオアセトアミド誘発肝線維化でのマクロファージ枯渇あるいは活性化実験(LPS投与)を行う。加えて、菌毒性であるLPSがどのように肝マクロファージに影響を与えるかを検討するための基礎実験も行う。さらに、イソプロテレノース誘発心筋線維化モデルとDibutyltin Dichloride誘導膵線維化モデルも作製し、マクロファージと筋線維芽細胞の特性をM-M axisに基づいて臓器横断的に解析する。
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