2015 Fiscal Year Annual Research Report
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26292175
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
沼田 英治 京都大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (70172749)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
後藤 慎介 大阪市立大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (70347483)
志賀 向子 大阪市立大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (90254383)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 昆虫 / 生理学 / 時間生物学 / 光周性 / 時計遺伝子 / 中枢神経系 / 幼若ホルモン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
【入力】光周性の光受容部である複眼中央部から視髄中央部を経由して脳へ至る神経経路のうち、posterior optic tractの対側視葉への投射を詳細に調べ、これらのファイバーとpigment-dispersing factor免疫陽性ファイバーが近くに投射していることがわかった。
【ホルモン】ホソヘリカメムシにおいて血リンパ中の幼若ホルモン（JH）濃度を液体クロマトグラフィー質量分析法（LC/MS）によって測定した。その結果、100μLという大量の試料でのみ検出が可能であった。
【時計】パラフィン切片を用いて時計タンパク質PERIODの免疫染色を行った結果、脳の後方に強く染色される細胞と、視葉と食道下神経節に弱く染色される細胞が見つかった。成虫の頭部全体を培養する方法を試みたが、当初はうまくいかなかった。酸素供給が十分になるように気管を空気中に開口させるなど方法を工夫した結果、７日間培養後、網膜電図（ERG）によって複眼が正常に機能していることが明らかになった。ただし、培養時の条件によってカビが生えることが多く、培地の種類や抗生物質の添加量、消毒方法を工夫して、ようやく頭部の培養が軌道に乗った。
【遺伝子】短日条件で30日休眠させ、短日条件または、短日から長日条件に移してから1,3,5日目のメス成虫の脳から抽出したtotal RNAをillumina HiSeqにより解析した。10サンプルから約2億3千万のリードを得た。この配列を元にde novoアッセンブリを行い、約7万6千の良好なコンティグを得たので、発現解析を現在進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
【ホルモン】ホソヘリカメムシの血リンパ中の幼若ホルモン濃度は非常に低いため少量の血リンパ中の、あるいは頭部培養液中の量を測定することは不可能である。
【時計】脳を複眼がつながった状態で取り出して培養することが困難であったので、頭部全体を培養する方針に変更した。しかし、それによって頭部に気門がなく酸素供給に問題があること、カビなど混入しやすいなどの困難に遭遇した。
【遺伝子】トランスクリプトーム解析には多量のRNAが必要なため、十分な量のRNAを得るための脳サンプルの取得に手間取った。
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| Strategy for Future Research Activity |
【ホルモン→遺伝子発現】幼若ホルモンの濃度を光周性の指標とすることは断念し、幼若ホルモン合成関連遺伝子の発現上昇を検知する系を使う方針である。
【時計】頭部全体を培養して一定日数生きているようになったので、今後は上記の遺伝子発現を指標として「頭だけでみられる光周性」を見出す実験に入り、その培養系でさらには時計遺伝子のRNAiを行う。
【遺伝子】ようやくトランスクリプトーム解析のデータは得られたので、早急に解析を行って、光周性によって発現が上昇、下降する遺伝子を見出す。
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| Causes of Carryover |
(1)ホルモン濃度の測定ができなくなった。(2)培養実験の系確立が遅れた。(3)トランスクリプトーム解析が遅れた。以上の理由で、それらの結果に基づいて行う分子レベルの各種実験に必要な薬品類の購入等が行われなかったことが主な理由である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
(1)について、光周性の指標とするものをホルモンから遺伝子発現に切り替えた、(2)について、頭部の培養が可能になった。(3)について、トランスクリプトーム解析の外注が完了した。以上により問題点は解消した。したがって、平成28年度にはこれまで遅れていた実験を鋭意行うことで残額を使用する見通しである。
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