2014 Fiscal Year Annual Research Report
血管と免疫のクロストークによる敗血症発症機構の解明と治療薬開発への応用
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26293014
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Research Institution | Osaka University |
Principal Investigator |
岡田 欣晃 大阪大学, 薬学研究科(研究院), 准教授 (50444500)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
土井 健史 大阪大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (00211409)
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Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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Keywords | 血管内皮細胞 / Robo4 / シグナル伝達系 / 炎症 / 敗血症 |
Outline of Annual Research Achievements |
Robo4のノックアウトが血管内皮細胞の炎症を抑制するメカニズムを明らかにするために、Robo4ノックダウンにより発現変動する遺伝子の解析を行った。まず、HUVECにControl もしくはRobo4 siRNA を導入しRNAを抽出後、マイクロアレイによる解析を行った。その結果、Robo4のノックダウンは、IκB 結合分子や複数のVEGFレセプター関連因子の発現を抑制することが明らかになった。これらの結果から、Robo4は血管内皮細胞においてVEGFシグナル伝達系、特にNF-κB経路に寄与する可能性が示された。 また、Robo4下流のシグナル伝達系をさらに詳細に解析するために、Robo4細胞内ドメイン結合因子の解析を行った。アデノウイルスベクターを用いてFlagタグ融合Robo4、もしくはコントロールタンパク質(GFP)を強制発現したHUVECから抽出液を調製し、Flag抗体を用いて免疫沈降を行った。各サンプルに含まれるタンパク質をマススペクトルを用いたショットガン解析により同定、比較しRobo4結合分子の同定を行った。その結果、未だ機能の詳細が不明な炎症シグナル伝達因子ファミリーの分子、細胞遊走や接着に寄与する細胞骨格結合因子、エンドサイトーシス関連因子など、複数の結合因子の同定に成功した。また、これらのうち炎症シグナル伝達因子は、Robo4の細胞内ドメインのうち、これまで機能が報告されていないC末端領域に結合することも明らかになった。以上の結果から、Robo4の炎症応答や細胞遊走における多彩な機能が発揮されるメカニズムの一端が明らかになった。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
マススペクトルを用いた解析の条件を予定より短期間で最適化でき、相互作用因子の同定を早期に達成することができたため。
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Strategy for Future Research Activity |
同定したRobo4結合因子とRobo4の機能の関連について解析を進める。また、血管内皮細胞と免疫細胞とのクロストークについても共培養系を用いた解析を進めていく。
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Causes of Carryover |
当初の予定より研究が順調に進捗したため、予算執行額が少なく抑えることができた。
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Expenditure Plan for Carryover Budget |
残額を次年度研究費に上乗せし、研究スピードを更に向上させるために有効活用する。
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[Journal Article] Endothelial cell-specific expression of roundabout 4 is regulated by differential DNA methylation of the proximal promoter2014
Author(s)
Okada Y, Funahashi N, Tanaka T, Nishiyama Y, Yuan L, Shirakura K, Turjman AS, Kano Y, Naruse H, Suzuki A, Sakai M, Zhixia J, Kitajima K, Ishimoto K, Hino N, Kondoh M, Mukai Y, Nakagawa S, García-Cardeña G, Aird WC, Doi T
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Journal Title
Arterioscler Thromb Vasc Biol
Volume: 34(7)
Pages: 1531-1538
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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