2016 Fiscal Year Annual Research Report
創薬標的としてのカルシウム依存性イオンチャネル機能複合体群の分子薬理学的研究
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26293021
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
今泉 祐治 名古屋市立大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (60117794)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山村 寿男 名古屋市立大学, 薬学研究科(研究院), 准教授 (80398362)
鈴木 良明 名古屋市立大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (80707555)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 薬理学 / 薬学 / 生体分子 / 生理学 / 生物物理 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
①軟骨細胞における正帰還Ca2+制御機構の異常と細胞機能の関連の解明：低浸透圧刺激による細胞膨張後に起こる容積の減少（Regulatory volume decrease: RVD）において、ClCチャネルを介した細胞外へのCl-輸送が重要な役割を担うことが知られている。我々は、軟骨モデル細胞(OUMS-27)を用いて低浸透圧感受性電流に対して、ClC-3が主要な成分の1つであることを明らかにしてきた。OUMS-27に対してCl-チャネル阻害薬やsiClC-3を適用してClC-3活性を阻害したところ、低浸透圧刺激によって引き起こされるRVDや細胞内Ca2+濃度上昇、PGE2産生が有意に抑制された。また、定常時のMMP-3およびMMP-13発現量の減少や細胞内Ca2+濃度の減少も観察された。
当研究室でOUMS-27より発見したBKチャネルの新規スプライスバリアント体BKαΔe2の機能を詳細に解析した。その結果、BKαΔe2自身は機能を持たないがストイキオメトリー依存的にBKチャネル機能を抑制することを明らかにした。また、OUMS-27に対してBKαΔe2のsiRNAを処置したところヒスタミンによって誘発されるCOX2発現が上昇した。BKαのうちexon2に含まれるアルギニン残基がBKチャネルの正常な膜発現および電位感受性に必要であることを明らかにした。これらの結果はJ Biol Chem誌にて発表した。
②疾患モデルにおける正帰還Ca2+制御機構の異常と細胞機能の関連：低酸素ストレスを与えた脳血管内皮（低酸素脳症モデル）において、Kir2.1の発現上昇がストア作動性Ca2+流入を増大させ、細胞増殖を亢進させることを明らかにした（BBRC, 2016）。興味深いことに脳血管内皮細胞株では正常酸素下においてHIF-1が発現しており、低酸素刺激によってHIF-1発現が減少することでdynamin-2発現が増大することが明らかになった。このdynamin-2発現増大がKir2.1のタンパク質発現量及び細胞膜発現量の上昇を引き起こすことを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①軟骨モデル細胞において、ClC-3が
（１）低浸透圧ストレスを感知して種々の生理応答（RVD、細胞内Ca2+濃度上昇、PGE2の放出）に関与すること、
（２）定常時の細胞内Ca2+濃度およびタンパク質分解酵素の発現調節に関わることを明らかにした。これらの成果について、現在論文を作成中である。
また、我々がOUMS-27から新規に同定したBKチャネルのスプライスバリアント体の生物物理学的性質と軟骨細胞機能への影響を明らかにした。特に、ストイキオメトリー依存的にシングルチャネルコンダクタンスや細胞膜移行を抑制するという、新たなイオンチャル活性制御機構を明らかにした。これらの成果は、J Biol Chem誌にて掲載された。また骨代謝学会の「1st Author」にも取り上げられ、近日掲載予定である。
②脳血管内皮細胞モデルにおいて、低酸素ストレスがKir2.1チャネル発現を上昇させ、正帰還機構を介して細胞内Ca2+濃度上昇を促進し、細胞増殖を亢進させることを明らかにした。この現象は、脳虚血時の血液脳関門の破綻機構の一端を担う可能性がある。これらの成果の一部はBBRC誌にて掲載され、これに続く成果は現在論文投稿中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
①これまでに、軟骨細胞や脳血管内皮細胞において正帰還機構に関連する分子群（Ca2+活性化K+(KCa)チャネル、Kirチャネル、ストア作動性Ca2+(SOC)チャネル、ClCチャネルなど）の同定とその機能・生理的意義を明らかにしてきた。本年度では、イメージング解析によってこれらの分子群が分子複合体を形成するか明らかにする。特に、上記の細胞におけるKCaチャネルとSOCチャネルの各種刺激後の位置関係は明らかにされていないので、重点的に解析を行う。カベオラなどの脂質ラフトがKCaチャネルの局在化や、ストア作動性Ca2+流入の足場に関係するということが知られている。そこで、カベオラ構成分子であるカベオリン１の遺伝子欠損マウスやカベオリン１のノックダウン実験により、カベオラの正帰還機構への関与を明らかにする。また、細胞膜と小胞体を結びつける分子であるジャンクトフィリンが心筋などの興奮性細胞のみならず、腺細胞や免疫細胞などの非興奮性細胞において機能発現することが明らかになってきている。そこで、ノックダウン実験によりジャンクトフィリンの正帰還機構に対する寄与やSOCチャネル構成因子（STIMやOrai）間のカップリングに対する役割を明らかにする。
②動物を用いた疾患モデルとして変形性関節症や動脈硬化のモデルを作製し、正帰還機構に関与する分子群（イオンチャネル、足場タンパク質）の、病態モデルにおける発現変化を明らかにする。そして、これまで細胞レベルで得られてきた知見が個体レベルでも当てはまるか解明する。
③当研究室にて独自に開発を進めている新規イオンチャネル標的創薬高効率探索系を用いて、KCaチャネルや静止膜電位形成に関与するリークK+チャネルを標的とした活性化薬・阻害薬の探索を行う。
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| Causes of Carryover |
①疾患モデルとして変形性関節症(OA)モデル動物を作製して実験を行う予定であった。しかし、OUMS-27細胞を用いた実験が長引いたため、OAモデル動物の作製・バリデーションを十分に行うことができず、使用額に差が生じてしまった。
②非興奮性細胞であるマクロファージにおいても正帰還機構が存在するか、またカベオリンがCa2+シグナルに対してどのような役割を担うか明らかにする予定であった。しかし、マクロファージを用いた実験結果が安定しなかったため、十分な検討が行えず、使用額に差が生じた。
③「細胞死を測定するイオンチャネル標的創薬スクリーニング法」をKCa チャネルおよびリークK+チャネル作用薬のスクリーニングへ応用する予定であった。しかし、スクリーニング系のバリデーションに時間を費やしてしまったため、大規模化・自動化を目的とした共同研究の開始が遅れてしまい、当初使用する予定だった予算を使用しなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
①OUMS-27から取得すべきデータはおおむね得ることができたので、動物由来の正常軟骨を用いた実験を開始する。また、学外の整形外科等との共同研究により、変形性関節症モデル動物の作製を行い、疾患モデルにおける正帰還機構の変化を明らかにする。
②学内の免疫学の専門家の協力を得て、マクロファージを用いた実験系の立ち上げを行う。特にMCSFを用いた骨髄由来のマクロファージを用いた実験を行い、再現性の良い結果を得るように工夫する。
③24ウェルプレート上での手動操作によるスクリーニング系のバリデーションに見通しがついたので、東京大学の創薬オープンイノベーションセンターとの共同研究により、大規模化・自動化を行う。また、大規模化合物ライブラリー（1万検体程度）を購入して、シード化合物の発見を目指す。
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