中間径フィラメント蛋白質の時空間動態制御機構の解明

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26293038
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 寺田 純雄 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (00262022)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 川岸 将彦 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (60323606) ; 齊藤 健太 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (60374659) ; 佐藤 啓介 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (60644044)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 細胞骨格 / 中間径フィラメント

Outline of Annual Research Achievements

１．蛍光蛋白質標識中間径フィラメント蛋白質発現トランスジェニックマウス作成、生体内における動態観察準備－蛍光偏光顕微鏡観察のために中間径フィラメント蛋白質を立体的位置関係が固定された状態でGFP標識する。他の中間径フィラメント蛋白質と生理的に共重合し、蛍光偏光を発する変異体の構築に成功しているが、その内因性の性質に更に影響を与えにくい標識法について最終的な検討を続行している。条件が決定次第神経系において当該のコンストラクトを発現させたトランスジェニックマウスを作成する予定である。また今年度購入した機材により、薄層斜光照明法、簡易蛍光偏光測定（偏光軸２方向）が研究代表者の分野内で利用できるようにセットアップを行った。ほぼ完了した状態である。生体内観察については実際の計測系において予備的な検討を開始している。
２．原子間力顕微鏡による中間径フィラメント蛋白質動態の超解像観察－SW13vim-細胞に中間径フィラメント蛋白質を発現させ、中間径フィラメント重合促進薬剤作用下に重合体を形成させた。その途中、膜剥離処理を行い原子間力顕微鏡により中間径フィラメント蛋白質重合体の構造を観察することに成功した。更なる分解能向上のため、重合体の基質への固定を強める必要があり、そのための新たな条件検討を開始した。
３．酵母遺伝学を利用した神経系中間径フィラメント蛋白質の動態関連因子探索－出芽酵母中間径フィラメント蛋白質欠損株に中間径フィラメント蛋白質遺伝子を導入し、重合・脱重合動態と生育への影響の観察を開始している。。
４．ケミカルスクリーニング、遺伝子チップ、質量分析等による神経系中間径フィラメント蛋白質動態調節因子の探索－調節因子関連分子、化合物の探索を続行している。新たな候補分子が見つかりつつある。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

標識条件の検討事項が多岐にわたり、蛍光偏光観察に使用するトランスジェニックマウス作成がやや遅れている一方で、偏光観察系のセットアップは順調に進行している。原子間力顕微鏡による中間径フィラメント蛋白質動態の観察については一応の結果を得たが、より高分解能の解析を目的として膜剥離処理後にあらたに標本固定の工夫を加えることで実験を続行している。酵母遺伝学を利用した実験系については中間径フィラメント蛋白質欠損株に中間径フィラメント蛋白質を導入する最初の実験を開始した。現在のところ動態や生育への明らかな影響は観察されていない。また、ケミカルスクリーニングについては、新規薬剤のスクリーニングに加えて、これまでの実験の結果得られた薬剤について、免疫沈降法により結合タンパク質を精製し、これを質量分析により同定する実験を進行中である。

Strategy for Future Research Activity

トランスジェニックマウス作成を目指して研究を推進する。原子間力顕微鏡による観察については空間分解能を向上させ論文発表を目指す。

Causes of Carryover

二偏光分岐光学システムの購入に際し割引価格で購入可能であったことと、海外旅費を別途調達したこと、およびトランスジェニックマウス作成費用等次年度に費用の使用を延期した計画が生じたため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

トランスジェニックマウス作成を予定する他、原子間力顕微鏡による動態観察の空間分解能を向上させ、成果発表を目指す。新たな免疫沈降の実験等も開始しているので、このための費用にも充当する予定である。