2014 Fiscal Year Annual Research Report
記憶の長期保持に関わる新規代謝型受容体とスプライシング異型による分泌蛋白の解析
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26293044
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| Research Institution | National Institute for Physiological Sciences |
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Principal Investigator |
久保 義弘 生理学研究所, 分子生理研究系, 教授 (80211887)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
今野 幸太郎 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (20599641)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 代謝型受容体 / オーファン受容体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
オーファン代謝型グルタミン酸受容体 Prrt3は、長いN末端細胞外領域を有する7回膜貫通型の受容体である。
1. 我々は、先に、脳に発現するPrrt3タンパク質の特異抗体を用いたwestern blot解析により、N末端細胞外領域が根元付近で切断された、受容体が存在することを見出した。切断は、当初、細胞外に放出されるprotease、tPA, Neuropsin, Neurotrypsin 等によると推測したが、これらの遺伝子破壊マウスでもPrrt3の切断は同様に観察された。今年度、細胞内でのタンパク質のプロセシングに関わるpro-protein convertase (PCs) によるものと推測し、遺伝子発現系を用いた実験を行ったところ、PCのひとつであるFurin によって、Prrt3が、少なくとも部分的に切断されることが確認された。なお、Furin の遺伝子破壊マウスは致死であるため、Furin 非存在マウスで、Prrt3の切断が起きなくなるかどうかについては、解析できていない。
2. 我々は、Prrt3の機能を知る手がかりを得るために、免疫共沈タンパク質の、質量分析装置を用いた解析による分子同定を行った。その結果、たくさんの候補分子のリストが得られたが、非特異的ではないと判断できるものとして、グルタミン酸トランスポーター EAAT1, EAAT2、G蛋白質alpha oサブユニットが見い出された。このことから、Prrt3が、興奮性シナプス前終末に局在するGo 共役型受容体であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
N末端細胞外領域を切断する酵素を探索し、proprotein convertase (PC)のひとつである Furin が、限定的ではあるが切断能力を有することを見出し、その研究成果を日本神経科学学会にて発表することができた。また、分子複合体を構成するタンパク質の同定を目指し、免疫共沈タンパク質の質量分析解析を行い、EAAT2, EAAT1, Galpha i/o 等を見出し、その研究成果を日本生理学会にて発表することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
N末端細胞外領域が切断されたタンパク質とフルサイズのタンパク質のどちらが、より機能を発揮するのかを決定することを目指す。機能解析にあたり、何をモニターすれは良いかを決定すことが、オーファン受容体の解析において重要なポイントとなるが、Prrt3の場合、免疫共沈して複合体を作っているGタンパク質 alpha o とカップルする可能性が高い。そこで、G alpha o- GIRK チャネルをエフェクター系として用いて、電気生理学的解析を行う。
条件的遺伝子破壊ホモのマウスがなかなか生存せず、個体数の確保に苦労してきたが、ようやく生存するケースを得ることができた。そこで、交配と繁殖を続け、充分数の個体を得て、網羅的行動解析を行うことを目指す。
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| Causes of Carryover |
今年度、生理学的解析の方針決定に必須である、共沈タンパク質同定等の生化学的実験を優先して行ったため、電気生理学記録機器の購入に至らなかった。また、網羅的行動解析については、充分な個体数を確保するための交配、繁殖にとどまり、行動解析に至らなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度使用額と、平成27年度の交付額を使用して、光・電気生理学的記録機器の購入を行う。年度内に、行動解析実験が開始できた場合には、その実験費用を支出する。
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