2014 Fiscal Year Annual Research Report
ネオグライコバイオロジクスの創製とリソソーム病治療薬開発への応用
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26293120
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
伊藤 孝司 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 教授 (00184656)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
辻 大輔 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 助教 (00423400)
広川 貴次 独立行政法人産業技術総合研究所, 創薬分子プロファイリング研究センター, 研究員 (20357867)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ネオグライコバイオジクス / リソソーム病 / エンドグリコシダーゼM / N型糖鎖オキサゾリン誘導体 / タンパク-タンパク相互作用 / 酵素補充療法 / 疾患iPS細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
組換え糖タンパク質を用いるバイオ医薬品の問題点である、糖鎖の不均一性に基づく有効性低下と副作用を改善すべく、本研究では、遺伝性リソソーム酵素欠損症（リソソーム病）を対象に、標的細胞内取り込みに必要、かつ均一な機能性合成糖鎖付加型の組換えヒトリソソーム酵素（ネオグライコ酵素）の作製技術開発と疾患モデルを用いる有効性評価を進めている。
平成26年度は、
1.組換えカイコ絹糸腺から精製したヒト活性型カテプシンA（CTSA）をエンドグリコシダーゼH（endoH）で処理して得られる、GlcNAc１残基を含む糖タンパクアクセプターとして、また均一N型糖鎖ドナーとして、高マンノース型糖鎖、末端シアル含有２分岐型および末端α-ガラクトース含有２分岐型糖鎖のオキサゾリン誘導体を用い、改変型エンドグリコシダーゼM（endoM N175Q）のトランスグリコシレーション作用により、CTSAに上記の均一N型糖鎖を20％以上の効率で付加することに成功した。
2.研究分担者の広川（産総研）が、GM2ガングリオシド分解能をもつ改変型β-ヘキソサミニダーゼB（HexB）との結合親和性増大を予測してアミノ酸置換型GM2活性化タンパク（GM2A）をin silicoデザインした。代表者の伊藤が、同GM2A、正常ヒトGM2AとN型糖鎖追加型GM2Aの発現ベクターを作製してメタノール資化酵母に導入し、各GM2Aの恒常発現株を樹立し、培養上清からの精製を試みている。また研究協力者の大髙（徳島大薬）らは、複数のアミノ酸置換型GM2Aの化学合成に成功した。
3.研究分担者の辻（徳島大薬）が樹立した、HexA及びCTSA欠損症患者由来iPS細胞株から、京都大iPS細胞研の井上治久教授らの方法に従い、大脳皮質神経細胞を分化誘導する方法を開発した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1. N型糖タンパクアクセプターとして組換えカイコ絹糸腺からヒトカテプシンA（CTSA）を大量精製でき、また高マンノース型糖鎖などの均一N型糖鎖オキサゾリン誘導体の作製と改変型エンドグリコシダーゼMのトランスグリコシレーション作用により、CTSAに均一N型糖鎖を20％以上の効率で付加することに成功したこと。
2. in silicoデザインとアミノ酸置換導入に基づく、改変型GM2活性化タンパク（GM2A）を恒常発現するメタノール資化酵母株の樹立と、複数のアミノ酸置換型GM2Aの化学合成に成功したこと。
3. HexA及びCTSA欠損症患者由来iPS細胞株から大脳皮質神経細胞を分化誘導する培養条件を確立できたことなどから、H26年度の目的は概ね達成できたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後も当初の計画に従い、研究を推進するが、
1. N型糖タンパクアクセプターとしてのヒトリソソーム酵素を大量精製でき、また均一なN型糖鎖オキサゾリン誘導体の合成や調製法は確立できたので、今後は均一N型糖鎖のアクセプターへの付加効率を60%以上まで向上させることを目的とする。
2. in silicoデザインとアミノ酸置換導入に基づく、改変型GM2活性化タンパク（GM2A）を、恒常発現メタノール資化酵母株の培養上清から精製とともに、化学合成改変型GM2Aの改変型HexBやGM2との結合、またin vitroでの機能を検証する。
3. HexA及びCTSA欠損症患者由来iPS細胞株から分化誘導した大脳皮質神経細胞の培養系に投与し、改変型HexBやGM2Aの細胞内取り込みや有効性を検討する予定である。
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| Causes of Carryover |
356,400円の余剰分はBack crossﾏｳｽの凍結胚作製が遅延したため次年度へ。H27. 4.24に支払済み。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
Back crossマウスの凍結胚をH27. 3.18に、徳島大学大学院医歯薬学研究部・総合研究支援センター・動物資源部門にて個体に戻し、同動物実験施設にて飼育・実験を行う。
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Research Products
(31 results)
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[Journal Article] In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology?2014
Author(s)
Gallat, F.-X., Matsugaki, N., Coussens, N.P., Yagi, J.K., Boudes, M., Higashi, T., Tsuji, D., Tatano, Y., Suzuki, M., Mizohata, E., Tono, K., Hatui, Y., Yabashi, M., Nango, E., Itoh, K., Coulibaly, F., Tobe, S., Ramaswamy, S., Iwata, S. and Chavas, M. L.
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Journal Title
The Royal Society
Volume: 369
Pages: 20130497
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Pim-2 kinase is an important target of treatment for tumor progression and bone loss in myeloma2014
Author(s)
Hiasa, M., Teramachi, J., Oda, A., Amachi, R., Harada, T., Nakamura, S., Miki, H., Fujii, S., Kagawa, K., Watanabe, K., Endo, I., Kuroda, Y., Yoneda, T., Tsuji, D., Nakao, M., Tanaka, E., Hamada, K., Sano, S., Itoh, K., Matsumoto, T. and Masahiro Abe, M.
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Journal Title
Leukemia
Volume: 29
Pages: 207-217
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] 改変型β-ヘキソサミニダーゼの有効性を評価2015
Author(s)
北風 圭介,田崎 智佳子,水谷 安通,杉山 栄二,神谷 真子,瀬藤 光利,浦野 泰照,櫻庭 均,伊藤 孝司
Organizer
臨床遺伝学公開シンポジウム2015「リソソーム病 現在と未来」
Place of Presentation
明治薬科大学（東京都清瀬市）
Year and Date
2015-03-12
Invited
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[Presentation] 新規タンパク質チオエステル調製法の開発2014
Author(s)
津田 雄介, 重永 章, 傳田 将也, 佐藤 浩平, 北風 圭介, 中村 太寛, 猪熊 翼, 伊藤 孝司, 大髙 章
Organizer
第53回日本薬学会・日本薬剤師会・日本病院薬剤師会中国四国支部学術大会
Place of Presentation
広島国際会議場(広島県広島市)
Year and Date
2014-11-08
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[Presentation] 組換えカイコ由来ヒトリソソーム酵素の分子特性とグライコシンターゼによる in vitro 糖鎖修飾2014
Author(s)
西岡 宗一郎, 小林 功, 辻 大輔, 原囿 景, 久保 勇樹, 真板 宣夫, 池戸 駿介, 東 哲也, 辻 大輔, 瀬筒 秀樹, 町井 博明, 石井 明子, 川崎 ナナ, 伊藤 孝司
Organizer
第5回グライコバイオロジクス研究会
Place of Presentation
臨床研究情報センター(兵庫県神戸市)
Year and Date
2014-11-01
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[Presentation] トランスジェニックカイコ由来ヒトリソソーム酵素の分子特性解析とグライコシンターゼによる糖鎖修飾2014
Author(s)
西岡 宗一郎, 小林 功, 辻 大輔, 原囿 景, 久保 勇樹, 真板 宣夫, 池戸 駿介, 東 哲也, 辻 大輔, 瀬筒 秀樹, 町井 博明, 石井 明子, 川崎 ナナ, 伊藤 孝司
Organizer
第87回日本生化学会大会
Place of Presentation
国立京都国際会館（京都府京都市）
Year and Date
2014-10-18
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[Presentation] 組み換えカイコ絹糸腺由来ヒトカテプシンAの分子特性とエンドグリコシダーゼによる糖鎖改変2014
Author(s)
西岡 宗一郎, 小林 功, 辻 大輔, 原囿 景, 久保 勇樹, 真板 宣夫, 池戸 駿介, 東 哲也, 辻 大輔, 瀬筒 秀樹, 町井 博明, 石井 明子, 川崎 ナナ, 伊藤 孝司
Organizer
第33回日本糖質学会年会
Place of Presentation
名古屋大学豊田講堂（愛知県名古屋市）
Year and Date
2014-08-10
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[Presentation] トランスジェニックカイコ由来ヒトリソソーム酵素の分子特性解析と化学酵素法に基づく人工糖鎖修飾2014
Author(s)
西岡 宗一郎, 小林 功, 辻 大輔, 原囿 景, 久保 勇樹, 真板 宣夫, 池戸 駿介, 東 哲也, 辻 大輔, 瀬筒 秀樹, 町井 博明, 石井 明子, 川崎 ナナ, 伊藤 孝司
Organizer
第55回日本生化学会 中国・四国支部例会
Place of Presentation
愛媛大学城北キャンパス(愛媛県松山市）
Year and Date
2014-06-06
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