2014 Fiscal Year Annual Research Report
ACFを標的とした新しい高感度分子イメージング法の開発
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26293176
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
高山 哲治 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 教授 (10284994)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中川 忠彦 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 学術研究員 (40634275)
佐野 茂樹 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 教授 (20226038)
六車 直樹 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 准教授 (90325283)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ACF / 分子イメージング / 蛍光プローブ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、まずaberrant crypt foci (ACF)の分子イメージングを行うためにACFに特異的に発現する分子を検討した。大腸腺腫患者を対象に拡大内視鏡下にACFを観察後、生検採取したACF組織よりRNAを抽出し、マイクロアレイ解析を行い特異的に発現するmRNAを検索した。この結果得られた、各種候補遺伝子の発現をTaqman PCRによりvalidation したところ、GST-π、epidermal growth factor receptor (EGFR), platelet derived growth factor receptor (PDGFR), glut-1, cadherin, beta-catenin, c-MET, SLC7a7, TRIM29の10遺伝子の過剰発現が確認された。さらに、免疫染色を行いACF組織におけるこれらの遺伝子の蛋白質発現を確認した。一方、本研究では動物発癌モデルを用いたACFのイメージング研究も計画していることから、動物のACF組織を用いてこれらの10遺伝子の発現を検討した。azoxymethane誘導ラット大腸発癌モデルを作成し、ACF組織を採取してTaqman PCRを行ったところ、ラットではglut-1, EGFR, PDGFR, GST-π、などの過剰発現を確認した。以上より、まずglut-1に対する標識プロープとしてD-glucosamine hydrochlorideよりTexas red標識化合物である2-TRG [Texas Red (sulforhodamine 101 acid)- coupled 2-amino- 2deoxyglucose]を合成した。また、PDGFRの基質であるダサチニブを基に蛍光標識プローブを作成した。EGFR, GST-πに対する標識プローブも間もなくできる予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は、ヒトACF組織を用いてマイクロアレイ解析を行い、正常大腸組織に比べて過剰発現する10遺伝子(GST-π, EGFR, PDGFR, glut-1, cadherin, β-catenin, c-MET, SLC7a7, TRIM29)を抽出することができた。また、今後のラットを用いた研究も視野に入れ、ラット化学発癌モデルのACF組織の検索も行い、GST-π, EGFR, PDGFR, glut-1はラットACFにおいても過剰発現することを見出した。さらに、glut-1, PDGFRに対する蛍光標識プローブを作成することができた。EGFR, GST-πに対する標識プローブも作成できる状況にある。このように、平成26年度はACFに発現する標的分子を絞り込み、それらに対する蛍光標識プローブの作成まで行ったという点で概ね初めの計画を達成していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、上記の蛍光標識プローブを多量に作成し、培養細胞を用いてそれぞれのプローブの有効性及び特性を評価する。また、蛍光プローブの生細胞に対する反応動態を明らかにする。その後、大腸癌細胞の同所移植モデル及びazoxymethane誘導ラット大腸発癌モデルを用いてACF(及び腺腫)のイメージングを行い、各プローブの有用性を検討する予定である。
1)培養細胞を用いた各種蛍光プローブの特性の解析：培養大腸癌細胞に蛍光プローブを添加し、Flow-cytometryにより蛍光強度の変化などを調べ、Eadie-Hofstee plot解析により反応速度及び反応動態を明らかにする。
2)大腸癌細胞の同所移植モデルを用いた分子イメージング: 標的分子を過剰発現する培養大腸癌細胞と発現しない細胞をヌードマウスのS状結腸(または直腸)に同所移植を行い、4週間後に屠殺して摘出S状結腸(または直腸)にex vivoで蛍光プローブを散布し、蛍光顕微鏡を用いて観察する。経時的に観察して至適反応時間を調べる。経時的に観察して至適反応時間を調べる。さらに、動物用蛍光内視鏡を用いてS状結腸(または直腸)の癌を観察し、イメージングを確認する。
3)Azoxymethaneラット大腸発癌モデルにおけるACFの観察：ラットにazoxymethaneを腹腔内投与し、8週後にラットを屠殺、すぐに大腸を摘出してex vivoで大腸粘膜に蛍光プローブを散布する。37℃で3～15分間インキュベートしたのち、蛍光顕微鏡下にACFを観察する。さらに、動物用蛍光内視鏡を用いてACFのイメージングを行う。
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| Causes of Carryover |
まず、ヒト大腸のaberrant crypt foci (ACF)における遺伝子のマイクロアレイ解析及び各遺伝子のTaqMan PCR解析などが当初の予定よりも順調に進んだため、これらの試薬やプライマーなどの経費が抑制された。その一方で、標的遺伝子に対する蛍光標識プローブを複数合成したが、その一部は蛍光物質の付加により反応性が低下するなどの問題が生じ、プローブの合成の実験が少し遅れた。そのため、蛍光標識プローブを用いたin vitroの実験、培養細胞を用いてプローブの特性、反応性などを調べる実験が少し遅れる結果となり、これらにかかる経費が抑制された。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
現在、反応性の良い蛍光標識プローブが合成されつつあるので、これらのプローブの標的分子との反応性、蛍光特性などを調べるためin vitroの実験を行う予定である。また、種々の培養大腸癌細胞を用いて、それぞれの蛍光標識プローブの特性、反応性、反応動態などを調べるとともに、経時的な細胞内局在の解析も行う予定である。さらに、動物を用いたin vivoのイメージング研究を行う予定である。
尚、本研究では多種類の培養細胞株を扱う必要があるため、細胞培養に関連して実験に研究補助員を雇用する予定である。また、得られた研究成果の発表及び研究結果を議論するため、一部の経費を学会参加のための出張旅費に当てる。
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[Journal Article] B-RAF mutation and accumulated gene methylation in aberrant crypt foci (ACF), sessile serrated adenoma/polyp (SSA/P) and cancer in SSA/P2015
Author(s)
Inoue A, Okamoto K, Fujino Y, Nakagawa T, Muguruma N, Sannomiya K, Mitsui Y, Takaoka T, Kitamura S, Miyamoto H, Okahisa T, Fujimori T, Imoto I, Takayama T
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Journal Title
Br J Cancer
Volume: 112
Pages: 403-412
DOI
Peer Reviewed
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