リアノジン受容体構造安定化による心不全・心肥大・致死的不整脈の包括的治療戦略

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26293189
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 矢野 雅文 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90294628)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小田 哲郎 山口大学, 医学部附属病院, 助教 (40569290) ; 小林 茂樹 山口大学, 医学部附属病院, 講師 (90397993)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: Ca2+ハンドリング / リアニジン受容体 / 筋小胞体 / CPVT

Outline of Annual Research Achievements

RyR N4103K/+　knock-in (KI)マウス、TroponinT Glu160欠損HCM型トランスジェニックマウスにおけるCaM結合親和性の検討と高親和性CaMによる介入:
Alexa633あるいはHiLyte Fluor 647でラベルしたCaM(F-CaM)をサポニン処理した単利心筋細胞に添加し、サルコメア上にならんだ蛍光強度を定量することでRyR2に結合したCaMを測定可能である。申請者らはCaM LD内に突然変異をもつRyR2 N4103K KIマウス、TACマウス、Glu160欠損HCM型トランスジェニックマウスにおいても同様にF-CaMを用いてCaMのRyR2に対する結合親和性を測定するとともに、RyR2高親和性GSH-CaMによる介入でCa2+ハンドリングの改善、抗不整脈効果が認められるか否かを検討する。実験ではTACモデルにおいてCaMのRyR2に対する親和性が低下していることが判明した。またRyR2高親和性GSH-CaMによりCa2+ spark頻度の低下や、SR Ca2+ contentの増加などCa2+ハンドリングの改善も認められた。さらにRyR2 N4103K KIマウスにおいても同様にCaMのRyR2に対する親和性が低下していることが判明した。
CaM高親和性RyR knock-in(KI)マウスの作成：
申請者らはすでにCaM BDに点突然変異を組み込んだペプチドを28種類作成した。作成した多数のCaM BDの変異ペプチドの中からCaMへの結合が最も強いものを２種類の方法でスクリーニングした。こうしてCaM高親和性RyR2変異を決定し、その変異を組み込んだKIマウスを申請者らは2013年１月にES細胞作成し、2014年３月納入、現在順調にmatingを続けhomo miceも誕生している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

計画と比べTroponinT Glu160欠損HCM型トランスジェニックマウスの部分はやや遅れているが、CaM高親和性RyR knock-in(KI)マウスの部分では進んでいるところもある。

Strategy for Future Research Activity

今後新たな心不全・心肥大・致死的不整脈の包括的治療戦略を確立するため、最新の知見をもりこみつつ、計画の実行に向けて努力する。

Causes of Carryover

今回の研究遂行のため非常に重要なマウスの作成の計画を旧来のES作成方式で計画していたが、ゲノム編集の技術が時間的にも経済的にも有利であるためCAS9を用いたゲノム編集によるKIマウス作成に切り替えたため、当初の予算について未使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

この未使用額については、現在ゲノム編集を用いたKIマウスの作成が大変順調に進んでおり、このマウス作成に使用する予定である。

Research Products

• [Journal Article] A low-dose β1-blocker in combination with milrinone improves intracellular Ca2+ handling in failing cardiomyocytes by inhibition of milrinone-induced diastolic Ca2+ leakage from the sarcoplasmic reticulum. (2015)
  • Author(s): Kobayashi S, Susa T, Ishiguchi H, Myoren T, Murakami W, Kato T, Fukuda M, Hino A, Suetomi T, Ono M, Uchinoumi H, Tateishi H, Mochizuki M, Oda T, Okuda S, Doi M, Yamamoto T, Yano M
  • Journal Title: PLoS One Volume: 10 Pages: e0114314
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0114314
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Comparison of neointimal coverage and extra-stent lumen between sirolimus and everolimus-eluting stent using optical coherence tomography. (2015)
  • Author(s): Oda T, Okamura T, Yamada J, Miyagi N, Uehara H, Nao T, Tateishi H, Maeda T, Nakamura T, Shiraishi K, Nakashima T, Nishimura S, Miura T, Matsuzaki M, Yano M
  • Journal Title: Heart Vessels Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1007/s00380-015-0630-z
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] New quantitative method to diagnose coronary in-stent restenosis by 64-multislice computed tomography. (2015)
  • Author(s): Yoshimura M, Nao T, Miura T, Okada M, Nakashima Y, Fujimura T, Okamura T, Yamada J, Matsunaga N, Matsuzaki M, Yano M
  • Journal Title: J Cardiol Volume: 65 Pages: 57-62
  • DOI: 10.1016/j.jjcc.2014.03.013
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Enhanced binding of calmodulin to RyR2 corrects arrhythmogenic channel disorder in CPVT-associated myocytes (2014)
  • Author(s): Fukuda M, Yamamoto T, Nishimura S, Kato T, Murakami W, Hino A, Ono M, Tateishi H, Oda T, Okuda S, Kobayashi S, Koseki N, Kyushiki H, Yano M
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun Volume: 448 Pages: 1-7
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2014.03.152
  • Peer Reviewed / Open Access