2014 Fiscal Year Annual Research Report
アノイキス抵抗性に基づいた網羅的な肺癌ドライバー遺伝子特定の研究
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26293197
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
佐藤 光夫 名古屋大学, 医学部附属病院, 講師 (70467281)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
近藤 征史 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00378077)
長谷 哲成 名古屋大学, 医学部附属病院, 助教 (30621635)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | アノイキス / 不死化正常ヒト気管支上皮細胞 / 変異KRAS / p53 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
【目的】応募者開発の正常ヒト気管支上皮細胞発癌モデル（HBEC）を用い、アノイキス抵抗性に基づいた網羅的な腫瘍抑制ドライバー遺伝子の特定を目的とする。アノイキスとは細胞外マトリックスへの接着を失った細胞におこるアポトーシスであり、アノイキス抵抗性は代表的な癌細胞の悪性形質である。【実験計画の概要】肺癌の悪性形質獲得に関与する腫瘍抑制性の“肺癌ドライバー遺伝子”の特定を目的とし、日本人由来の正常ヒト気管支上皮細胞モデル（HBEC）を樹立し、その細胞を用いて網羅的かつ機能的スクリーニングを行い、さらに、特定された遺伝子の腫瘍抑制作用を解析する。【これまでの進捗状況】日本人由来の不死化正常ヒト気管支上皮細胞においてプールshRNAによる網羅的ノックダウンを行う前の準備として、まず、cdK4とhTERTの導入によりすでに不死化済みのHBEC4細胞（欧米人由来）に、変異KRAS導入とp53ノックダウンを単独およびコンビネーションで導入した。導入の成功をウエスタンブロットで確認した。次に、これらのHBEC4細胞においてプールshRNAによる網羅的ノックダウンを行った。5,000 遺伝子ずつのプールとして提供された2つのプールRNA 干渉レンチウイルスプールをウイルスパッケージングベクターミックスと共ににヒト胎生腎細胞株293T 細胞にコトランスフェクションし、レンチウイルス粒子を作成した。十分なタイタ―のウイルスが得られている事を確認した。今後は、アノイキス抵抗性の評価として、軟寒天中の増殖評価および超非接着フラスコにおける増殖評価を行う。さらに、これらのアノイキス抵抗細胞を回収し、次世代シークエンスにて定量する予定である。また、日本人由来の不死化正常ヒト気管支上皮細胞の樹立も推進していく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
プールshRNAのウイルスパッケージングを完了した。既に不死化済みのHBEC4細胞に変異KRAS導入とp53ノックダウンを単独をおよびコンビネーションで導入したのち、プールshRNAのウイルス感染を行っており、概ね順調と判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでは、すでに不死化された欧米人由来の正常ヒト気管支上皮細胞を使用して来たが、今後は、研究計画にあるように性別、喫煙歴、年齢の異なる日本人から採取した正常気道上皮を不死化し、研究を進めていく。これにより人種差等の背景因子が癌化に与える影響についても評価していく。
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