2014 Fiscal Year Annual Research Report
分泌蛋白質キナーゼの制御機構の解明と関節リウマチ治療への応用
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26293233
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
竹内 勤 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (50179610)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中川 種昭 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (00227745)
仲 哲治 独立行政法人医薬基盤研究所, その他部局等, その他 (30303936)
鈴木 勝也 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (70306695)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 関節リウマチ / キナーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
①FAM20A発現ベクターの作成・タンパクの精製
FAM20AおよびCの完全長cDNAを PCR法を用いてクローニングした。FAM20Aのタンパクの精製のため、4種類のタグと、293T細胞へ3種類の発現系を試みた。最終的に数百ugのFAM20AおよびFAM20Cリコンビナントタンパクを高純度(>90%)で精製することができた。
②キナーゼ活性の検討
精製したFAM20Aを用いてキナーゼ活性を検討した。positive controlとして基質配列が同定されているFAM20Cキナーゼを用いた（FAM20Cは2価の重金属存在下で特定の配列のSer残基をリン酸化することが知られており、FAM20AはFAM20Cに最もアミノ酸配列が近い事が知られている）。Intavis社の高密度ペプチドアレイに、放射線ラベルしたATP、および反応に必要となる可能性のある重金属とFAM20A/Cを添加し複数回検討を行ったところ、FAM20CがSer基質で反応は認められるものの、FAM20Aは特異的なスポットを認めなかった。
そのため、FAM20Aが稀なタンパク、稀な配列を基質にしている可能性を考えた。ノックアウトマウスの研究結果を参考に基質候補分子を絞りタグ付きタンパクで精製した。これらをFAM20Aと反応させ、放射線ラベルしたATPを利用する方法と、リン酸化タンパクとのみ反応して泳動が遅くなるという特徴のPhostag gelを用いた方法でリン酸化を検出しようと試みたが、いずれのタンパク・検出系でもFAM20Cによるリン酸化は認められるものの、FAM20Aによるリン酸化は認められなかった。
FAM20Aの機能の解明をすすめるとともに、今後はリコンビナント蛋白を用いた抗体作成し、マーカーとしての利用可能性につき検討を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
キナーゼ活性については予想に反した結果であったが、バイオマーカーについては進展が認められてるため。
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| Strategy for Future Research Activity |
FAM20Aの機能の解明をすすめるとともに、今後はリコンビナント蛋白を用いた抗体作成し、マーカーとしての利用可能性につき検討を行う予定である。
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