関節リウマチ特異的iPS細胞を用いた骨髄間葉系細胞の分化と機能異常の解明

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26293236
• Research Institution: Tokyo Medical University
• Principal Investigator: 西本 憲弘 東京医科大学, 医学部, 兼任教授 (80273663)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中田 研 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (00283747) ; 村上 美帆 東京医科大学, 医学部, 助教(特任) (30595591) ; 斎藤 潤 京都大学, その他部局等, 准教授 (90535486)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 関節 / 骨髄 / 単球 / ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞） / 破骨細胞

Outline of Annual Research Achievements

重症の関節リウマチ(RA)患者の骨髄では、癌特異的抗原を細胞表面に発現しているCD14+CD15+の表現型を有する単球系細胞が見られ、骨髄での単球の初期の分化・増殖の異常がRAの病態形成に関与する可能性がある。そこで、RA特異的iPS細胞を樹立し、in vitroで単球への分化・増殖の異常を検討した。単球への分化過程でCD14+CD15+細胞は一過性に検出され、またその割合は健常人由来に比べて、RA由来iPS細胞で有意に高かった。単球は関節破壊に関る破骨細胞の前駆細胞でもあるため、iPS 細胞から破骨細胞への分化に異常があるか否かを検討した。単球分化刺激下の単核球からCD14 陽性分画を分取し、M-CSFおよびRANKLにより破骨細胞への分化誘導を行った。RA患者由来iPS細胞から分化した破骨細胞は、健常者由来iPS 細胞と比べ、細胞数、骨吸収能ともに有意に亢進していた。更には、炎症性サイトカインが破骨細胞の分化に関与しているのか検討した。IL-6は、骨芽細胞上のRANKL の発現を誘導し、そのRANKLは、破骨細胞前駆体に発現するNF-κB 活性化受容体と結合し破骨細胞へと分化を誘導する。しかし、この破骨細胞分化過程において、IL-6の破骨細胞前駆体に対する直接作用は依然controversialである。そこで、iPS細胞由来単球細胞から破骨細胞への分化誘導中のIL-6の機能を検討した。RA患者由来iPS細胞から分化させた単球細胞および破骨細胞はIL-6を産生したが、その内在性IL-6は破骨細胞への分化には直接関与しなかった。また、IL-6を添加したところ、RA患者由来単球細胞からRANKL依存的破骨細胞への分化に影響しなかった。一方IL-6は、破骨前駆細胞の細胞融合または巨大化を促進する可能性があり、可溶性IL-6受容体は、IL-6依存性破骨前駆細胞の巨大化を阻害した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

疾患特異的iPS細胞の樹立に成功し、RA患者5例を含む7例のドナーからiPS細胞を樹立できている。さらに、in vitro分化系を用いて、単球への分化の初期段階でCD14+CD15+細胞が出現し、RA患者由来iPS細胞において、その出現率が高いことを明らかにした。この結果より、CD14+CD15+細胞の出現が、RA患者の骨髄におけるサイトカインの発現など環境因子ではなく、RAの遺伝的因子あるいはエピジェネティックな修飾に起因する可能性を示唆している。さらに、RA患者由来iPS細胞から、破骨細胞への分化系を確立した。そこで、破骨細胞分化過程における炎症性サイトカインの一つであるIL-6 の破骨細胞前駆体に対する直接作用を検討したが、RA患者由来単球細胞からRANKL依存的破骨細胞への分化を阻害しなかった。これらの経過から、当初の3年の計画全体のほぼ90％は達成できたといえる。

Strategy for Future Research Activity

1)遺伝子解析
CD14+CD15+細胞の出現が、RA患者の骨髄におけるサイトカインの発現など環境因子ではなく、RAの遺伝的因子あるいはエピジェネティックな修飾に起因する可能性があるため、大阪大学・岡田教授の協力により、次世代シークエンサーやSNPマイクロアレイ等を使用し、RA患者とその同胞健常人のiPS細胞のゲノム解析を行い、RA特有の遺伝的因子あるいはエピジェネティックな修飾を探求する。
2)RA特異的iPS細胞を用いた単球系細胞への分化実験
RA特異的iPS細胞を単球へ高純度に分化させ、各分化段階での遺伝子発現をマイクロアレイで網羅的に解析し、健常人由来のiPS細胞と比較することで、細胞分化異常がどの分化段階で生じるかを明らかにする。過去2年間で抽出したRNAの質が悪く、マイクロアレイ解析には不十分である。これはiPS細胞の初期分化で、死細胞比率が高いことに起因する。生細胞を選別することで、これを解決したい。各分化段階での遺伝子発現を網羅的にかつ経時的に解析することにより、血球分化のkeyとなる分子が同定できる可能性がある。
3)RA特異的iPS細胞から破骨細胞への分化実験
RA特異的iPS細胞から単球へ分化させ、さらにRANKLを添加することで破骨細胞へ分化誘導を行い、破骨細胞への分化効率と骨吸収能の違いを健常人由来のそれと比較検討する。破骨細胞への分化効率と骨吸収能の違いが、どのようなメカニズムで生じているのかを明らかにする。Cathepsin K、MMP-9など分化マーカー、接着分子の発現の違いを明らかにする。

Causes of Carryover

次年度使用額が生じた理由としては、研究成果が学会発表の水準にまで達しなかった部分があり、学会などへの出張を行わなかったため、旅費が発生しなかったことがあげられる。

Expenditure Plan for Carryover Budget

これらの金額と次年度以降に請求する研究費を合わせた使用計画としては、遺伝子解析のために使用することを計画している。