2014 Fiscal Year Annual Research Report

難治性脳形成障害胎児脳より樹立した神経幹細胞を用いた分子病態解析と治療法の探索

Research Project

Project/Area Number	26293253
Research Institution	Kyoto Prefectural University of Medicine
Principal Investigator	伏木信次京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80150572)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	伊東恭子京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (80243301) 金村米博独立行政法人国立病院機構大阪医療センター(臨床研究センター), 先進医療研究開発部・再生医療研究室, 室長 (80344175)
Project Period (FY)	2014-04-01 – 2017-03-31
Keywords	先天異常学 / 神経幹細胞 / 難治性脳形成異常
Outline of Annual Research Achievements	難治性脳形成障害（脳分離障害、神経細胞増殖異常、神経細胞移動異常、タナトフォリック骨異形成症(以下TD)、L1CAM遺伝子異常に伴う水頭症などが含まれる）の分子病態解明を目指して、胎児の前頭葉から樹立した神経幹細胞（以下NSCs）の培養を開始した。正常由来のNSCsと疾患由来NSCsの間で細胞増殖と細胞移動能を比較したところ、複数の疾患由来NSCsにおいて増殖または細胞移動能の差異が認められた。特に、脳分離障害の一例、タナトフォリック骨異形成症由来(FGFR3遺伝子のR248C点変異を有するライン) の一例において、細胞増殖能の有意な低下がみられた。人為的に遺伝子発現改変を施してサブラインを樹立することで、遺伝子変異の有無、遺伝子発現量、病態との関連を科学的に証明するためのツール作製を進めた。今年度はそのパイロット研究として、神経幹細胞増殖能に差異を示したTD由来NSCsに着目した。正常由来のNSCsに対して、点変異を持つFGFR3遺伝子の導入によるTD病態の再現、点変異FGFR3を有するNSCsに対して、ドミナントネガティブ変異体の導入あるいはshRNAによるノックダウン処理で、TD様病態が正常化するかどうかの検討を可能にすべく、レンチウイルスベクター構築に着手した。 NSCsからミニブレインを構築する方法の確立を目指して、培養液の組成の検討と、三次元培養器具などの検討を行った。ミニブレイン構造体の評価方法として薄切後の各種細胞種マーカー蛋白を対象とした免疫組織染色法にて検討した。予備的観察ではあるが、スピナーフラスコを用いる方法と、ロータリーベセルを用いる方法では産物の構造には大差はないと思われるが、前者では支持組織として使用しているマトリゲルの回転子による物理的破壊が目立ち継続培養が難しい場面も経験した。また、多検体を同時に処理するための設備環境をさらに整備する必要がある。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 研究協力者の一人として予定していたポスドク1名の着任時期が遅れ、マンパワーが不足したため、初年度の計画がやや遅れている。 NSCs培養を開始した当初は、Sphereの浮遊状態が安定せず苦労したが、低接着フラスコの使用により安定化が図れた。Sphereを形成させて増殖維持させるという細胞の性質上、細胞増殖や細胞移動能といった細胞の基本性質を解析する上でも、通常の手法が適用できないことが多いが、試行錯誤して現実的で合理的な手法を適用し、結果を導き出している。使用可能なNSCsラインは、正常由来もTD由来もともに個体数が限られるため、分子生物学的手法を用いて人為的にFGFR3遺伝子発現改変を施してサブラインを樹立することで、遺伝子変異の有無や遺伝子発現量と病態との関連が科学的に証明できると考えられる。この考えに沿って遺伝子発現改変のためのツール作製を進めた。今年度内に野生型および点変異FGFR3のコーディング領域全長のcDNAクローニングを終え、ドミナントネガティブ変異体のベクター構築にまで至った。インテグラーゼによるゲノム挿入法がNSCsに適用できなかったことは誤算であったが、ウイルスベクターによる導入で問題を解決すべく、早急にウイルス実験計画を学内遺伝子組換え実験委員会に申請・承認を得て、現在進行形で解決に向け取り組んでいる。ヒト由来NSCsの倍加速度が非常に遅いことを考慮して、27年度に予定していたミニブレイン構築の作業を前倒しするかたちで条件検討を開始したことは評価されるべき点である。
Strategy for Future Research Activity	今年度前期にレンチウイルスベクターによるFGFR3遺伝子改変NSCsサブラインを複数作製し、NSCsの諸性質・シグナル伝達変動・遺伝子発現プロファイルなどの情報を取得する。初年度より踏み込んだ解析とくに大脳の前後軸に沿った領域化メカニズムにも検討を加えるために、FGFリガンド種類とFGFR3変異の関係を明らかにし、また、部位特異的マーカー遺伝子のレポーターなどを駆使した解析に取り組む。並行して、脳分離障害、L1CAM遺伝子変異に伴う水頭症由来のNSCsに関しても同様の解析を進める予定である。 NSCs培養系は初年度と同様に、二次元、三次元の両者を併用するが、特に三次元におけるTD様病態モデル樹立のための検討に重きをおく。多検体を同時に処理するための設備環境をさらに整備しつつ、マトリゲルに替わる他の支持体の適用も考慮する。
Causes of Carryover	実験補助員として予定していたポスドクの着任が遅れたため、人件費の一部が次年度未使用額となった。
Expenditure Plan for Carryover Budget	今年度前期にレンチウイルスベクターによるFGFR3遺伝子改変NSCsサブラインを複数作製し、NSCsの諸性質・シグナル伝達変動・遺伝子発現プロファイルなどの情報を取得する。初年度より踏み込んだ解析とくに大脳の前後軸に沿った領域化メカニズムにも検討を加えるために、FGFリガンド種類とFGFR3変異の関係を明らかにし、また、部位特異的マーカー遺伝子のレポーターなどを駆使した解析に取り組む。並行して、脳分離障害、L1CAM遺伝子変異に伴う水頭症由来のNSCsに関しても同様の解析を進める予定である。 NSCs培養系は初年度と同様に、二次元、三次元の両者を併用するが、特に三次元におけるTD様病態モデル樹立のための検討に重きをおく。多検体を同時に処理するための設備環境をさらに整備しつつ、マトリゲルに替わる他の支持体の適用も考慮する。