次世代シーケンサーによる膵癌早期診断マーカー同定と低侵襲十二指腸液検査法への応用

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26293285
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 小寺 泰弘 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (10345879)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 神田 光郎 名古屋大学, 医学部附属病院, 助教 (00644668) ; 山田 豪 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院講師 (30467287) ; 藤井 努 名古屋大学, 医学部附属病院, 講師 (60566967)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 低侵襲スクリーニング法 / 膵腫瘍 / 氏世代シーケンサー

Outline of Annual Research Achievements

膵癌の予後改善のためには早期診断が最も重要な課題である。本研究では、臨床応用に直結しうる膵癌の新規遺伝子学的低侵襲スクリーニング法を開発することを目的とする。現行の画像検査を中心とした診断法を凌駕する臨床的有用性を備えた早期診断マーカーの条件として、浸潤癌へと進展する前の高異型度前癌病変の段階で特異的に現れる、低侵襲に採取可能な検体から検出できる、という点が重要である。本研究では、次世代シーケンサーによる網羅的体細胞変異検索により膵癌の段階的発癌過程新規分子マーカーを同定し、これを高感度遺伝子変異検出技術で臨床検体から検出することを目標とする。
１，次世代シーケンサーを用いて、正常膵管、膵癌前癌病変の各段階、浸潤性膵管癌での体細胞変異を網羅的に検索し、段階的癌化の過程それぞれの遺伝子変異パターンを明らかにする。
２、前癌病変が浸潤癌へと移行する段階に特徴的に出現する体細胞変異に着目し、新規の膵癌発癌を予測しうるマーカーおよび変異パターンを同定する。
３、ターゲット変異が各種臨床検体から検出可能であるかを高感度変異検索技術であるCast-PCR法あるいはdigital high resolution melt curve analysis (HRM)を用いて調べる。
４、検出されたターゲット変異と、画像所見や病理組織学的所見との対比、長期経過を調べることで、その臨床的意義を明らかにする。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

微小病変からの高純度なDNA検体を必要検体数分確保する作業が予想以上に困難であり、期間を要したが、現在、膵癌段階的発癌過程の各段階を対象とした次世代シーケンサーによる網羅的遺伝子変異解析が開始されている。臨床検体の収集は進んでおり、次世代シーケンサーの結果を得てターゲット変異が絞り込めた時点で、次の段階に移行する準備はできている。

Strategy for Future Research Activity

次世代シーケンサーによる網羅的遺伝子変異解析結果が得られ次第、高度異型前癌病変に移行する段階で特異的に出現する遺伝子変異を検索する。入手した各種臨床検体からの核酸抽出をDNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen)により行い、均一かつ高品質なDNA検体を準備する。微量な遺伝子変異を検出するためには、高感度な遺伝子変異解析手法が必須である。正確性および再現性を高めるため、2つの高感度遺伝子変異解析法を行う予定である。0.1％の変異allele存在率まで検出可能であることを予備実験にて確認している、Cast PCR法とdigital HRM法を用いる。平成27年度は、のちの収集臨床検体からの変異検出に向けて、10例程度の臨床検体を対象に、一連の行程を確認する予定である。

Causes of Carryover

網羅的解析において要求される品質を安定して得ることが困難であったため、若干の達成度に遅れを生じており、そのため次年度使用額を生じている。

Expenditure Plan for Carryover Budget

標的遺伝子変異が決定され次第、予定されていた研究計画を遂行するために、繰り越した経費を使用する計画である。