2014 Fiscal Year Annual Research Report
経口血小板増多剤による肝硬変に対する新規肝再生、線維化改善及び発癌予防法の確立
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26293296
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
大河内 信弘 筑波大学, 医学医療系, 教授 (40213673)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
千葉 満 弘前大学, 保健学研究科, 講師 (20583735)
村田 聡一郎 横浜市立大学, 医学部, 准教授 (40436275)
松原 由美子 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (70365427)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 肝硬変 / 経口血小板増多薬 / 肝再生 / 線維化改善 / 発癌予防法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
・エルトロンボパグの血小板増加モデル開発：エルトロンボパグはヒトとチンパンジーのTPO受容体にしか反応せず、マウスでは血小板増加効果が得られない。そのため、筑波大学生命科学動物資源センターにて、ヒトCD110(TPO受容体)を有するBAC DNAをマウス受精卵に導入し遺伝子改変マウスを作成した。4匹のBAC DNAマウスを作成し、繁殖を開始し、ヒトTPO受容体の発現しているマウスの作成に成功した。
・ヒトIPS細胞から巨核球、血小板の作成：CD34陽性骨髄幹細胞(5×105)をトランスフェリン無添加SF培地で、rhTPOおよびエルトロンボパグそれぞれを添加し巨核球及び血小板の作成に成功した。現状では巨核球の産生効率は約20%であった。
・エルトロンボパグの抗腫瘍効果の検討：ヒト肝細胞癌細胞株Huh7、HepG2、Hep3Bにエルトロンボパグを添加し、抗腫瘍効果をWST8, BrdUを用いて検討した。その結果いずれの癌細胞に対してもエルトロンボパグが抗腫瘍効果を持つことを明らかにした。
エルトロンボパグには白血病細胞に対する鉄キレート作用が報告されている。そこで肝癌細胞株にクエン酸鉄アンモニウム(FAC)を添加し鉄補充をすることでエルトロンボパグの抗腫瘍効果がキャンセルされることを確認した。
・エルトロンボパグの肝細胞癌に対する抗腫瘍効果のメカニズムの検討：iiと同様のヒト肝細胞癌細胞株にエルトロンボパグを投与すると、細胞周期関連タンパクp21、CyclinD1が低下し、TfRが上昇しており、flow cytometryではG2/M期の細胞が減少し、G0/G1期でのcell cycle arrestが生じていることがわかった。以上より、エルトロンボパグにHCCに対する抗腫瘍効果があること、さらにはメカニズムとしてcell cycle arrestによる抗腫瘍効果を有していることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヒトTPO受容体を有する遺伝子組み換えマウスの開発；BAC-DNAを用いてヒトTPO受容体をマウスに発現させた遺伝子組み換えマウスの作成に成功した。しかし、今年度は肝繊維化実験に供する数の確保ができなかった。
エルトロンボパグによって産生された血小板によるヒト肝星細胞抑制効果の検討；
ヒトiPS細胞から分化誘導した巨核球にエルトロンボパグおよび既存のTPO 製剤を作用させて血小板を産生させることには成功した。しかし作成された血小板の数が星細胞への効果検証実験に供するには不十分であり、引き続き条件を検討中である。
エルトロンボパグのヒト肝細胞癌株に対する抗腫瘍効果のメカニズムの検討；
エルトロンボパグの肝細胞癌に対する抗腫瘍効果は、鉄キレート作用によるcell cycle arrestであることを明らかにした。この結果を基にin vitroの系で現在検討中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
・昨年度作成した遺伝子導入マウスを繁殖させ、肝線維化モデルを作成しTPOまたはエルトロンボパグを投与、抗線維化効果を比較検討する。またヒト肝星細胞TWNT1に対する活性化抑制効果を、エルトロンボパグ又は既存のTPOでiPS細胞から作成した巨核球より産生させた血小板で比較検討する。具体的には作成したそれぞれの巨核球および血小板(5×104)をヒト肝星細胞に添加し、flow cytometryを用いαSMA発現陽性細胞率を計測する。
・エルトロンボパグのヒト肝細胞癌株に対する抗腫瘍効果のメカニズム解析のために、エルトロンボパグの肝細胞癌に対する鉄キレート作用についても合わせて検討する。加えてmessenger RNAおよびmicro RNAのマイクロアレイを用いて網羅的解析を行う。腫瘍を発光させて継時的に観察できる肝癌モデルを開発し、エルトロンボパグの肝細胞癌に対する抗腫瘍効果をin vivoで確認する。
・より効果的かつ効率的にヒト血小板を作成するためにiPS細胞に加えて、分化能に優れているヒト胎盤由来幹細胞を分離培養し、巨核球への分化誘導条件を検討する。分化誘導した巨核球にエルトロンボパグおよび既存のTPO 製剤を作用させて血小板を産生させる。エルトロンボパグによって産生された血小板が肝星細胞の増殖およびα-SMAの発現に抑制的に作用することが可能か検討する。
・肝細胞癌に対する唯一の抗癌剤であるソラフェニブとの併用効果を検討する。
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| Causes of Carryover |
26年度実験におけるヒトTPO受容体を有する遺伝子組み換えマウスの開発、エルトロンボパグによって産生された血小板によるヒト肝星細胞抑制効果の検討、ならびにエルトロンボパグのヒト肝細胞癌株に対する抗腫瘍効果のメカニズムの検討に関しての実験が順調に進んだため次年度の研究費に繰り越した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
実験計画に示してあるヒトTPO受容体の遺伝子導入マウスの繁殖、ヒトIPS細胞とヒト胎盤由来幹細胞からの巨核球及び血小板作成実験、臨床で肝細胞癌の治療薬として用いられているソラフェニブとエルトンボパグの併用効果について、ヒト肝癌細胞株を用いたin vitroの実験に各々振り分けて使用する。
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