網羅的蛋白質解析を利用した膵胆道癌早期診断法の確立とその分子機構解明に向けた挑戦

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26293299
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 宮崎 勝 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (70166156)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高野 重紹 千葉大学, 医学部附属病院, 助教 (20436380) ; 久保木 知 千葉大学, 医学部附属病院, 助教 (50571410) ; 吉富 秀幸 千葉大学, 医学部附属病院, 講師 (60375631) ; 加藤 厚 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (70344984) ; 清水 宏明 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (80272318) ; 大塚 将之 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (90334185) ; 賀川 真吾 千葉大学, 医学部附属病院, 助教 (90507302)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 癌 / 外科 / プロテオーム

Outline of Annual Research Achievements

１）2-DEによって見出された癌高発現候補蛋白cofilin-1の血中への逸脱による血管内に循環する抗原（候補蛋白）、その抗原に対する自己免疫反応により生成される自己抗体、さらにはそれらの複合体（抗原抗体複合体）をdetectするsandwich ELISAの系をそれぞれ作製し、その測定値が再現性のあるものかを検討した。まず最初に試みた抗原に対するELISA測定系では、再現性の得られる測定系は確立出来ず、自己抗体に対する測定系でも安定した値は得られなかった。それに対し抗原抗体複合体物質に対するsandwich ELISAでは、安定した再現性が得られ実験系を確立した。
２）血中の候補蛋白関連物質の存在量測定および血中マーカーとしての感度・特異度の検定。まず候補蛋白関連物質cofilin-1の膵癌と健常人においての測定値の違いを検討した。すると、膵炎患者検体を含めた3群間において、膵癌では健常人、膵炎と比較し、cofilin-1の血清中免疫複合体値は有意に高値であった。さらに、膵癌の進行度が進むにつれて、血清値は上昇し、Kaplan-Meier解析では中央値で高低値群の２群に分けると、高値群では有意に予後不良であった(p=0.039)。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度の研究結果に関しては、同定された候補蛋白の同定、validation、および血中の免疫複合体の測定系の確立等、予定されていた研究はおおむね順調に進展していると考えられる。さらにcofilin蛋白の免疫染色法による膵癌組織における蛋白発現の強弱と臨床病理学的特徴との相関を解析した。研究の進捗状況としては現在、膵癌細胞株を用いたcofilin蛋白の機能解析を行っているところである。今後、さらに今年度の研究を計画通り発展させていきたい。さらに外部への情報、成果の発信については、昨年度に癌学会の口演発表を含む２件行った。論文投稿に関しては今年中を目安に海外のjournalへの投稿を予定している。

Strategy for Future Research Activity

１）原発巣～血管内循環～遠隔巣に対する転移メカニズムへのアプローチ。現在有望な候補と思われるCofilinについては近年、いくつかの癌種で浸潤や遠隔巣への転移への関わりが報告されている。さらに、膵癌細胞においてはZebrafishを用いた研究によりCofilin pathwayの中でCofilinのリン酸化に関与するLIM kinaseを抑えることにより血管新生および転移に対する抑制効果を示す報告も認められてきている。これらの背景をもとに膵癌細胞株を用いて特異的siRNAおよびLIM kinaseの阻害剤を用いることでCofilinの膵癌細胞におけるin vitroでの機能解析（invasion assay, soft agar assay, pancreatosphere assay等）を行い、浸潤、転移巣への生着、転移巣でのself-renewal capacityおよび増殖能についての検討を行う。
２）膵癌マウスモデルPdx1CreKrasG12D/+p53fl/flにYFPをlabelingしたtransgenic mouse (PKCY mouse: Rhim AD , Stanger BZ et al. Cell 2012)よりprimary cultureしたmouse膵癌細胞を用いヌードマウスの膵臓に直接癌細胞を注射するorthotopic transplantation膵癌モデル, およびintraportal vein injectionによる肝転移モデルマウスを用い、CTCの数、p-CofilinのEMTさらにCofilinのMETへの関与をCofilin pathwayの活性化を抑制した際に実際に転移能が抑制されるかをin vivoで確認しcancer progressionにおける転移へのmechanismを解明していく。

Research Products

• [Presentation] 自己免疫複合体測定法による膵癌バイオマーカーの臨床学的意義 (2015)
  • Author(s): Shingo Kagawa, Shigetsugu Takano, Mamoru Satoh, Kazuyuki Sogawa, Hideyuki Yoshitomi, Hiroaki Shimizu, Masayuki Ohtsuka, Atsushi Kato, Katsunori Furukawa, Tsukasa Takayashiki, Satoshi Kuboki, Daiki Okamura, Daisuke Suzuki, Nozomu Sakai, Fumio Nomura, Masaru Miyazaki
  • Organizer: 第23回日本消化器関連学会週間 (JDDW2015)
  • Place of Presentation: グランドプリンスホテル新高輪・国際パミール・グランドプリンスホテル高輪（東京都品川区）
  • Year and Date: 2015-10-08 – 2015-10-11
• [Presentation] Identification of Cofilin as a useful biomarker in pancreatic cancer progression. (2015)
  • Author(s): Shigetsugu Takano, Mamoru Satoh, Kazuyuki Sogawa, Hideyuki Yoshitomi, Hiroaki Shimizu, Masayuki Ohtsuka, Atsushi Kato, Satoshi Kuboki, Shingo Kagawa, Kazuyuki Matsushita, Fumio Nomura and Masaru Miyazaki
  • Organizer: 第74回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場（愛知県名古屋市）
  • Year and Date: 2015-10-08 – 2015-10-10