microRNAをターゲットとした間葉系幹細胞による神経膠芽腫浸潤抑制療法の開発

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26293325
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 中溝 玲 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (80529800)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 溝口 昌弘 九州大学, 大学病院, 講師 (50380621) ; 吉本 幸司 九州大学, 大学病院, 講師 (70444784) ; 天野 敏之 九州大学, 大学病院, 助教 (70448413) ; 飯原 弘二 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90270727)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 間葉系幹細胞 / micro RNA / exosome / 悪性脳腫瘍

Outline of Annual Research Achievements

間葉系幹細胞 (MSC) 由来のexosomal miRNAが，GBM細胞（U87）の浸潤能に与える影響を解明するため，以下の実験を行った．
1) U87の細胞からmiRNAを含むtotal RNAを，MSCの培養液上清からexosomal miRNAを抽出した。網羅的なmiRNAの定量PCR解析を行い，（U87の細胞のmiRNAの⊿Ct） / （MSCのexosomal miRNAの⊿Ct）の比を算出し，比が-3以下かつMSC exosomal miRNAのraw Ctが33以下のものを抽出した．その結果，miR-154-5p，409-3p，127-3p，193a-5p，145-5p，143-3p，196a-5p，31-5pが同定された．
2) 1)で同定したmiRNAをU87 に過剰発現させ，transwell invasion assayを行った．その結果，miR-127-3p，145-5p，31-5pの過剰発現によって，浸潤能が有意に抑制された．
3) 2)で同定されたmiRNAをそれぞれ組み合わせてU87に過剰発現させ，transwell invasion assayを行った．その結果，hsa-miR-127-3p，145-5p，31-5pそれぞれを単独で過剰発現させた場合と同様に，miR-127-3p+145-5p，miR-127-3p+145-5p，miR-145-5p+31-5p，miR-127-3p+145-5p+31-5pの全ての組み合わせにおいて浸潤能が有意に抑制された．
4) MSCに過剰に発現されたmiRNAが，MSCが本来有するGBM指向性へ影響を与えるかを検証するため，3)と同様の組み合わせでmiRNAをMSCに過剰発現させ， transwell invasion assayを行った．この際，下のwellには，U87から得られたconditioned medium (serum free)を用いた．その結果，miR-127-3p，miR-127-3p+145-5p，miR-127-3p+145-5pの過剰発現によって，MSCのU87に対する遊走能が亢進することが明らかとなった．一方，miR-31-5p，miR-127-3p+145-5p+31-5pの過剰発現において，MSCの浸潤能が抑制されることが明らかとなった．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

U87細胞内において発現の程度が低く，かつ、MSC由来のexosomal miRNAにおいて発現が亢進しているmiRNAのうち，hsa-miR-127-3p，145-5p，31-5pをU87に過剰発現させることにより，U87の浸潤能が抑制されることが明らかとなった．また，上記3つのmiRNAを複数組み合わせても，U87の浸潤能は依然として抑制されていた．逆に，MSCにmiR-127-3p，miR-127-3p+145-5p，miR-127-3p+145-5pを過剰発現させ，U87のconditioned mediumをlower wellに用いたinvasion assayを行った結果，MSCのU87に対する遊走能は亢進することが明らかとされた．これらの結果は，miR-127-3p，miR-127-3p+145-5p，miR-127-3p+145-5pを過剰発現させると，MSCが本来有するGBM指向性を更に亢進させ，かつMSCから分泌されるexosomal miRNA-127-3pがGBMの浸潤能を抑制させる可能性を有している．
以上の結果より，研究は概ね順調に進展しているものと思われる．

Strategy for Future Research Activity

miR-127-3p，145-5p，31-5p及びそれぞれを組み合わせて過剰発現させたMSCから分泌されたexosomeを含むconditioned mediumによるU87の浸潤抑制効果をtranswell invasion assayを用いて検証する．また，Cy3で標識されたmiRNA-mimicを用いMSCにmiR-127-3p，145-5p，31-5pを過剰発現させ，MSCから分泌されたCy3で標識されたexosomal miRNAが実際にU87内へ取り込まれることで証明する.
これらが証明されれば，ex vivoにおいて長期間の観察が可能であるorganotypic culture methodを行う．具体的には，nude mouseから脳を摘出し，virotomeを用いてbrain sliceを作製し， Green fluorescent protein(GFP)で標識したU87と当該miRNA強発現MSCを大脳基底核（被殻）に作製したpinhole内にimplantする．U87の浸潤を蛍光顕微鏡で観察し， miRNA-127-3p強発現MSCによる浸潤抑制効果を検証する．

Causes of Carryover

学会参加のための旅費が，当初予想していたより安い金額で収まったため．

Expenditure Plan for Carryover Budget

transwell invasion assayなどの消耗品費として使用する．