microRNAをターゲットとした間葉系幹細胞による神経膠芽腫浸潤抑制療法の開発

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26293325
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 中溝 玲 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (80529800)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 溝口 昌弘 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (50380621) ; 吉本 幸司 九州大学, 大学病院, 講師 (70444784) ; 天野 敏之 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (70448413) ; 飯原 弘二 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90270727)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 間葉系幹細胞 / miRNA / 悪性脳腫瘍

Outline of Annual Research Achievements

1) 細胞浸潤抑制作用を有するmiRNAを過剰に発現した間葉系幹細胞（hMSC）が、U87グリーマ細胞の持つ浸潤能に対してcontact dependentあるいはcontact independentに与える影響について、transwell invasion assayを用いて検証した。Contact dependentな効果を調べるために、miRNAを過剰に発現させたhMSCとU87細胞を共培養して、U87細胞の浸潤能の変化について検討した。一方、contact independentな効果を調べるためには、hMSCのconditioned medium内で一定期間培養したU87細胞の浸潤能を検討した。共培養の実験では、miR-145-5p、miR-31-5p、miR-127+145、miR-145+31、miR-127+145+31の過剰発現が、U87細胞の浸潤能を有意に抑制した。特に、miR-145+31の組み合わせが、最も強く浸潤能を抑制した。一方、contact independentでは、いずれのmiRNAの組み合わせも有意なU87細胞浸潤抑制効果は見られなかった。
2) hMSC内に強発現したmiRNAが、共培養しているU87細胞内へと移動するかどうかについて検証した。alexa555-labeled miR-31を過剰発現させたhMSCとVybrant Dioで染色したU87細胞を共培養し、24時間後にはalexa555-labeled miR-31がU87細胞内に移行していることが観察された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

上記の結果より、hMSCに過剰発現させたmiRNAは、contact independent mechanismではなく、contact dependent mechanismを介してU87細胞内へ移動し、U87細胞の浸潤能に影響を与えていることが明らかになった。特にmiR-145+31の組み合わせが、最も強くU87細胞の浸潤能を抑制していた。またmiRNAの細胞間の移動は、alexa555-labeled miR-31とVybrant Dioを用いた実験により可視化できた。
平成26年度の研究結果では、miR-145+31の組み合わせは、hMSCに過剰発現させても、本来hMSCが持っているU87細胞に対する指向性に影響がないことを明らかにしている。それゆえ今後の方向性として、miR-145+31に注目し、研究を進めていくことが妥当であると考えている。
以上の結果より、研究は概ね順調に進展しているものと思われる。

Strategy for Future Research Activity

1) hMSCに過剰発現させるmiRNAをmiR-145+31に絞り、研究を進める。まずは、ex vivoにおいて長期間の観察が可能であるorganotypic culture methodを行う予定である。具体的には、胎児SDラットから脳を摘出し、virotomeを用いてbrain sliceを作製する。Green fluorescent protein(GFP)で標識したU87細胞とmiR-145+31を過剰発現させたhMSCを1:1で混ぜ、大脳基底核（被殻）に作製したpinhole内にimplantする。Brain slice内でのU87細胞の浸潤を経時的に蛍光顕微鏡で観察し、miR-145+31過剰発現hMSCによる浸潤抑制効果を検証する。
2) 次いで、miR-145+31のtargetとなるmRNAの発現変化を、マイクロアレイとRT-PCRにて検証する。特に、浸潤能に影響を与える可能性のあるmRNAの発現の変化に注目する。
3) 上記実験が順調に進展し、時間と研究費に余裕があれば、in vivoにてex vivoの結果が再現可能かどうかを検証する。

Causes of Carryover

マウスもしくはラットを用いたex vivo実験にて経費を使用する予定であったが、brain sliceモデルの作成に予定より時間がかかったため、予定していた動物の購入数より少なかった。そのため、残額が発生した。

Expenditure Plan for Carryover Budget

brain sliceモデルは既に確立されたため、ex vivo実験のための動物購入に使用する。