関節破壊を制御するマイクロRNAの統合的解析と軟骨における機能解析

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26293338
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 廣畑 聡 岡山大学, 保健学研究科, 教授 (90332791)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 成瀬 恵治 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (40252233) ; 西田 圭一郎 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (80284058) ; 伊藤 佐智夫 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (30335624)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 関節病学 / アグリカナーゼ

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は変形性関節炎(OA)の細胞外マトリックス分解に中心的な役割を果たす切断酵素、アグリカナーゼの遺伝子発現制御にかかわるmicroRNAを統合的に解析し、作用メカニズムを明らかにすることで関節破壊への役割を示すことである。

ヒト軟骨肉腫由来細胞株（OUMS-27)を用いた。OUMS-27にサイトカイン刺激（インターロイキン－１(IL-1β) + 腫瘍壊死因子(TNF-アルファ））を行ったところ、アグリカンの分解が促進され、アグリカナーゼ誘導性が確認された。そこで、OUMS-27に二つの異なった刺激（①サイトカイン刺激：インターロイキン－１(IL-1β) + 腫瘍壊死因子(TNF-アルファ）と②メカニカルストレス（ストレックス社製ST-140））を加えて、OUMS-27のRNAを用いてmicroRNA発現のアレイ解析を施行した。異なる二つの刺激により変動するmicroRNAをA～Dまでの４グループと既報のmicroRNAに近い変動パターンを含むEグループの計５つのグループに分類し、それぞれのmicroRNAが標的とするRNAにつき、データベース検索を行った。複数のデータベース解析を行い、重複して出現する候補が最も確率が高いものとして、マークするとともに細胞外マトリックスに関連する分子を標的とするmicroRNAを候補として優先的に選択した。
これらの解析により、標的分子を共通して有するいくつかの候補microRNAを同定することに成功した。これらのmicroRNAのOAに関する役割は既報になく、新規microRNAであることが明らかとなった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初予定していた通り、ストレス刺激によるmicroRNA発現変化の統合的な解析を実施した。
具体的には、二つのアルゴリズムを用いて、サイトカイン刺激時およびサイトカイン刺激にメカニカルストレス刺激を加えたときの二点において発現変化を来すmicroRNAを網羅的に解析を行った。また、メカニカルストレス単独刺激においても、ストレスの度合いを変化させることで細胞外マトリックス分子およびマトリックス分解酵素であるアグリカナーゼの発現量に違いがみられることが明らかとなったため、伸展率5％と10％で各マトリックス分子およびアグリカナーゼの発現がどの様に変化するのか定量的リアルタイムＰＣＲ法で明らかにした。
これらの成果は国内・国外学会において発表した。

Strategy for Future Research Activity

これまでの研究成果から、ターゲットとなるＲＮＡに対して働く候補microRNAが複数同定されてきたので、まずはターゲットＲＮＡがサイトカイン単独刺激と、サイトカインにメカニカルストレス刺激を追加した場合で発現がどの様に変化するかを検討する。microRNAが作用するとタンパクに翻訳されることなく分解してしまうと考えられるので、発現量をRNAレベルのみならずタンパクレベルでも検討を行う。すなわち、ウエスタンブロッティングにて検討することを計画している。次に、候補microRNAのうち、いくつかのものに着目し、ルシフェラーゼベクターに組み込み刺激によるプロモーター活性を検討する。さらに、候補microRNAに対するRNA干渉法をおこなうべく実験系を構築する。

Research Products

• [Journal Article] Interleukin-1β induced nuclear factor-κB binds to a disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin type 1 motif 9 promoter in human chondrosarcoma cells. (2015)
  • Author(s): Altuntas A, Halacli SO, Cakmak O, Erden G, Akyol S, Ugurcu V, Hirohata S, Demircan K.
  • Journal Title: Mol Med Rep. Volume: in press Pages: in press
  • DOI: 10.3892/mmr.2015.3444.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Low serum level of secreted frizzled-related protein 5, an anti-inflammatory adipokine, is associated with coronary artery disease. (2014)
  • Author(s): Miyoshi T, Doi M, Usui S, Iwamoto M, Kajiya M, Takeda K, Nosaka K, Nakayama R, Okawa K, Takagi W, Nakamura K, Hirohata S, Ito H
  • Journal Title: Atherosclerosis Volume: 233（2） Pages: 454-459
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] ADAMTS1 inhibits lymphangiogenesis by attenuating phosphorylation of the lymphatic endothelial cell-specific VEGF receptor. (2014)
  • Author(s): Inagaki J, Takahashi K, Ogawa H, Asano K, Hatipoglu OF, Zeynel Cilek M, Obika M, Ohtsuki T, Hofmann M, Kusachi S, Ninomiya Y, Hirohata S
  • Journal Title: Exp Cell Res. Volume: 323(2) Pages: 263-275
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] ADAMTS4 and ADAMTS5 Knockout Mice Are Protected from Versican but Not Aggrecan or Brevican Proteolysis during Spinal Cord Injury. (2014)
  • Author(s): Demircan K, Topcu V, Takigawa T, Akyol S, Yonezawa T, Ozturk G, Ugurcu V, Hasgul R, Yigitoglu MR, Akyol O, McCulloch DR, Hirohata S.
  • Journal Title: Biomed Res Int. Volume: 2014 Pages: 693746
  • DOI: 10.1155/2014/693746.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Early eicosapentaenoic acid treatment after percutaneous coronary intervention reduces acute inflammatory responses and ventricular arrhythmias in patients with acute myocardial infarction: A randomized, controlled study. (2014)
  • Author(s): Doi M, Nosaka K, Miyoshi T, Iwamoto M, Kajiya M, Okawa K, Nakayama R, Takagi W, Takeda K, Hirohata S, Ito H
  • Journal Title: Int J Cardiol. Volume: 176(3) Pages: 577-582
  • DOI: 10.1016/j.ijcard.2014.08.055.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] HYALURONAN REDUCED EXTRACELLULAR MATRIX DEGRADATION BOTH IN VITRO AND IN VIVO (2015)
  • Author(s): Takashi Ohtsuki, Yuri Shoji, Keiichi Asano, Aya Hirata, Teruyuki Kawadi, Junko Ingaki, Kanae Kumagishi, Keiichiro Nishida, Toshitaka Oohashi, Satoshi Hirohata.
  • Organizer: HA2015
  • Place of Presentation: フィレンツェ
  • Year and Date: 2015-06-07 – 2015-06-11
• [Presentation] Perinatal lethality in ADAMTS1 deficient mouse (2014)
  • Author(s): Satoshi Hirohata, Omer Faruk Hatipoglu, Eriko Kusunoki, Takashi Ohtsuki, Junko Inagaki, Keiichi Asano, Yuri Shoji, Teruyuki Kawadi, Aya Hirata, Yoshifumi Ninomiya
  • Organizer: American Society for Matrix Biology Biennial Meeting
  • Place of Presentation: 米国 クリーブランド
  • Year and Date: 2014-10-12 – 2014-10-15
• [Presentation] ADAMTS cleaved versican in tumor angiogenic area (2014)
  • Author(s): Keiichi Asano, Junko Inagaki, Matthias Hofmann, Teruyuki Kawadi, Aya Hirata, Yuri Shoji, Takashi Ohtsuki, Yoshifumi Ninomiya, Satoshi Hirohata
  • Organizer: American Society for Matrix Biology Biennial Meeting
  • Place of Presentation: 米国 クリーブランド
  • Year and Date: 2014-10-12 – 2014-10-15
• [Presentation] Decreased Sox9 mRNA expression by cytokine stimulation was ameliorated by hyaluronan in chondrosarcoma cells (2014)
  • Author(s): Takashi Ohtsuki, Satoshi Hirohata, Yuri Shoji, Keiichi Asano, Aya Hirata, Teruyuki Kawadi, Junko Ingaki, Kanae Kumagishi, Keiichiro Nishida, Toshitaka Oohashi, Aiji Ohtsuka
  • Organizer: American Society for Matrix Biology Biennial Meeting
  • Place of Presentation: 米国 クリーブランド
  • Year and Date: 2014-10-12 – 2014-10-15
• [Presentation] 変形性膝関節症の治療効果に関する生化学的解析 (2014)
  • Author(s): 熊岸加苗、大月孝志、廣畑 聡、河村顕治、大塚愛二、坂田賢一郎、坂田俊輔
  • Organizer: 第27回日本臨床整形外科学会学術集会
  • Place of Presentation: 仙台市
  • Year and Date: 2014-07-20 – 2014-07-21
• [Presentation] 胎生期ADAMTS1ノックアウトマウスの解析 (2014)
  • Author(s): 楠絵里子、稲垣純子、大月孝志、川地輝幸、平田彩、浅野恵一、マティアス ホフマン、二宮善文、廣畑 聡
  • Organizer: 第46回日本結合組織学会学術大会 第61回マトリックス研究会大会
  • Place of Presentation: 名古屋市
  • Year and Date: 2014-06-05 – 2014-06-07
• [Presentation] 担がんマウスモデルにおけるバーシカン分解の解析 (2014)
  • Author(s): 浅野恵一、稲垣純子、マティアス ホフマン、川地輝幸、平田彩、大月孝志、二宮善文、廣畑 聡
  • Organizer: 第46回日本結合組織学会学術大会 第61回マトリックス研究会大会
  • Place of Presentation: 名古屋市
  • Year and Date: 2014-06-05 – 2014-06-07
• [Presentation] ヒアルロン酸短期投与によるラット変形性関節症モデルの関節軟骨保護効果の検討 (2014)
  • Author(s): 大月孝志、廣畑聡 、障子友理、浅野恵一 、平田彩 、川地輝幸、稲垣純子、熊岸加苗、西田圭一郎、二宮善文
  • Organizer: 第46回日本結合組織学会学術大会 第61回マトリックス研究会大会
  • Place of Presentation: 名古屋市
  • Year and Date: 2014-06-05 – 2014-06-07
• [Presentation] ADAMTS1はVEGFCと結合してリンパ管新生を抑制する (2014)
  • Author(s): 稲垣純子、高橋克之、小川弘子、浅野恵一、Omer Faruk Hatipoglu、 Mehmet Zeynel Cilek、小比賀真就、大月孝志、 Matthias Hofmann、 草地省蔵、二宮善文、廣畑聡
  • Organizer: 第46回日本結合組織学会学術大会 第61回マトリックス研究会大会
  • Place of Presentation: 名古屋市
  • Year and Date: 2014-06-05 – 2014-06-07
• [Presentation] 新規X線造影剤による変形性膝関節症ラット関節軟骨の高解像度マイクロＣＴ造影 (2014)
  • Author(s): 大橋俊孝、加来田博貴、芳谷 学、大月孝志、大野充昭、山田翔也、前原亜美、廣畑 聡、西田圭一郎、窪木拓男、二宮善文
  • Organizer: 第46回日本結合組織学会学術大会 第61回マトリックス研究会大会
  • Place of Presentation: 名古屋市
  • Year and Date: 2014-06-05 – 2014-06-07
• [Presentation] Cyclic tensile strain (CTS) down-regulates interleukin(IL)-1β and Tumor necrosis factor(TNF)-α induced matrix degrading enzymes mRNA expression in human chondrosarcoma cell line OUMS-27 by mechano sensor. (2014)
  • Author(s): Ohtsuki T, Kawadi T, Hirata A, Asano K, Inagaki J, Kumagishi K, Nishida K, Ninomiya Y, Hirohata S
  • Organizer: International symposium on mechanobiology 2014
  • Place of Presentation: 岡山市
  • Year and Date: 2014-05-20 – 2014-05-23
• [Presentation] Creation of Novel Articular Cartilage Specific X-ray Imaging Probes Composed of Lysine Oligomers. (2014)
  • Author(s): Oohashi T, Hagaya M, Ono M, Yamada S, Ohtsuki T, Maehara A, Hirohata S, Nishida K, Kuboki T, Kakuta H, NinomiyaY.
  • Organizer: International symposium on mechanobiology 2014
  • Place of Presentation: 岡山市
  • Year and Date: 2014-05-20 – 2014-05-23
• [Presentation] ADAMTS1 inhibits lymphangiogenesis by attenuating phosphorylation of the lymphatic endothelial cell-specific VEGF receptor (2014)
  • Author(s): Junko Inagaki, Katsuyuki Takahashi, Hiroko Ogawa, Omer Hatipoglu, Mehmet Cilek, Masanari Obika, Takashi Ohtsuki, Shozo Kusachi, Yoshifumi Ninomiya, Satoshi Hirohata
  • Organizer: The 18th International Vascular Biology Meeting
  • Place of Presentation: 京都市
  • Year and Date: 2014-04-14 – 2014-04-17