2014 Fiscal Year Annual Research Report
内耳におけるアクチン構造様式とその制御の包括的解析
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26293369
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
北尻 真一郎 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (00532970)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
RAJ Ladher 独立行政法人理化学研究所, 発生・再生科学総合研究センター, 特別主管研究員 (70392173)
伊藤 壽一 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 名誉教授 (90176339)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | アクチン / 不動毛 / 根 / 聴力 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々が作成したTRIOBP-5(以下T5)アイソフォーム特異的 KO マウス(以下 T5KO マウス)の解析を進め、T5KO マウスが難聴を示すことを見出した。聴力解析の結果、T5KO マウスは T4/5KO マウスに比べ聴力の低下が緩やかであった。そして、T4/5KO マウスでは、消失していた内耳有毛細胞の不動毛の「根」が、T5KO では細いながらも存在していた。また、T5KO マウスの有毛細胞では TRIOBP-4(以下T4)が局在する「根」が存在するにも関わらず、TRIOBP-1(以下 T1)の根への集積が無くなっていた。これらの結果は、「根」は T4 のみでも束化されるが、十分な太さ・強度を持つためには、T1,T4の倍以上の長さを持つ分子である T5 が必要であることを示唆している。
「根」は他のアクチン細胞骨格と協働して形成される可能性がある。そこで、「根」の形成に関する TRIOBP 以外の分子、および TRIOBP の制御メカニズムを調べるため、TRIOBPに対する抗体を用いて内耳組織で免疫沈降を行い、相互作用するいくつかの受容体、接着分子、細胞骨格関連分子を同定した。その中には、蝸牛内環境の維持を担うタイト結合関連分子が存在しており、そのうち Occludin および ILDR1 について、遺伝子変異マウス を用いて解析を行った。その結果、これらも難聴の表現型を示すことがわかった(Higashi T., et al., J. Cell Sci., 2013)、(Kitajiri S., et al., Biol. Open, 2014)、(Katsuno T., et al., PLOS ONE, 2015)。今回共沈した分子群(アクチン結合タンパク質、細胞骨格関連分子、およびセカンドメッセンジャー等)からみても、TRIOBP が様々なアクチン形態形成に関わっている可能性は高い。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
作製したノックアウトマウスの解析により、根の太さと聴力などのデータが順調に得られている。
TRIOBPと恊働する分子を免疫沈降にて複数同定し、他に難聴に関わる分子が得られた。これらの知見の一部は論文として発表された。
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| Strategy for Future Research Activity |
精製タンパク質を用いた無細胞系において、精製 TRIOBP 各アイソフォームとアクチンを 反応させ電子顕微鏡にて検証する。各アイソフォーム間の相互作用、ヘテロ多量体等の解析、および TRIOBP の各アイソフォームの組み合わせによるアクチン線維束化様式の構造を詳細に解析する。
in vivoにおけるTRIOBPの機能解析の目的で、T4/5KO、T5KO、に加え、Cre/LoxPシステ ムを用いた T1 コンディショナル KO マウス(以下 T1cKO)を作製した。通常の T1KO マウスは 早期の胎生致死であった(未発表)。T1cKO マウスは、Six1-Cre、Emx2-Cre、Atoh1-CreER 等、 内耳特異的プロモーターを持つ Cre マウスと交配することによって、内耳特異的 T1KO マウスを作製することが可能である。さらに、T1 は T4,T5 と異なりユビキタスに発現パター ンを示すため、T1cKO マウスを用いて、各種臓器特異的プロモーターを持つ Cre マウスとの交 配により、耳以外の各臓器における T1 の機能解析も可能である。
TRIOBPを中心とした内耳におけるアクチン構造様式の制御メカニズム解明のため、引き 続き TRIOBP 結合タンパクの探索および解析を行う。これまで同定された、TRIOBP と相互 作用する分子の内耳における機能を解析し、内耳でのアクチン動態を包括的に検証する。
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| Causes of Carryover |
TRIOBP-1 コンディショナルKOマウスが得られた。これを各種Creマウスと交配するには、多数のマウスの飼育と交配は必要となる。相応のマウス飼育費に加え、公汎な表現形解析に伴い種々の試薬が必要になると見込まれるため、基金分を繰り越した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
TRIOBP-1のアクチン形態形成（発生を伴う）を、時空間的に解析する。またTRIOBP-4に対する抗体を作成し（現在用いているものは組織染色には使えるものの、ウェスタンブロットではワークしない）、これを用いてTRIOBP-4と恊働する分子を探索、機能解析する。
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