2014 Fiscal Year Annual Research Report
霊長類モデルを用いたドルーゼン生成機序の解明と予防薬の開発
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26293377
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| Research Institution | 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター) |
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Principal Investigator |
岩田 岳 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター), 分子細胞生物学研究部, 部長 (90374157)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
溝田 淳 帝京大学, 医学部, 教授 (10239262)
下澤 律浩 独立行政法人医薬基盤研究所, 霊長類医科学研究センター, 研究員 (50300786)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 医歯薬学 / 外科系臨床医学 / 眼科学 / 眼生化学・分子生物学 / ドルーゼン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
加齢黄斑変性症は中心視野が障害される難治性の眼疾患である。病態初期にドルーゼンが蓄積する網膜の環境や分子メカニズムは明らかにされていない。我々は生後２年でドルーゼンが黄斑部に観察される遺伝性のカニクイザルと加齢によるドルーゼン生成個体の比較を行ってきた。病理学的解析によってヒトに類似するドルーゼン組成であることが明らかとなり、網膜色素上皮細胞の形態、貪食能、タンパク分解能などが著しく低下していることも明らかになった。さらに遺伝性カニクイザルの家系について全エクソーム解析を実施したところ、２つの遺伝子変異で発症している可能性を明らかにした。本研究はドルーゼンが生成される黄斑部の環境を分子レベルで解明し、ドルーゼンの生成を遅延あるいは抑制する方法を考案することを目的とする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
候補となっている２つの遺伝子変異体が何らかの機能障害をもたらすと考えており、これらの変異体を網膜色素上皮細胞において強制発現させることによって、ドルーゼン個体から得られた網膜色素上皮細胞（RPE細胞）の状態と比較検討している。上皮系細胞からの離脱、細胞接着能の低下、貪食能の低下、オートファジー機能の低下などを観察している。また、変異体を強制発現しているプライマリーRPE細胞とドルーゼン個体から得られたRPE細胞の遺伝子パターンの遺伝子発現とRNA発現の解析結果についても比較検討している。変異体はタンパク質の機能阻害か新たな機能を獲得している可能性があり、RPE細胞株を用いて、ノックダウンの実験とFLAGタグを用いた免疫沈降による変異体結合タンパク質の同定を質量分析計によって行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
変異体のタンパク質構造解析を予定している。先ずはコンピューターのシュミレーションによる構造解析を行い、十分な情報が得られない場合にはタンパク質の精製と結晶化、X線構造解析を検討したい。X線構造解析の共同研究はすでに整っている。変異体を強制発現するマウスの検討を行っている。マウスには黄斑がないので、ドルーゼンの生成には黄斑の特徴的な組織構造が必要とされるのか、重要な疑問に答えるための実験である。トランスジェニックマウスの作製はCAG（チキン・アクチン）プロモーターを用いてマウスのRosa26ローカスにZFN（Zinc Finger Nuclease）によって特異的に切断し、変異体を１コピー挿入することを計画している。今回、家系の２６個体についてヒト用NimbleGen SeqCap 3.0を用いて全エクソーム・キャプチャーを行ったが、漏れているエクソンの可能性も否定できない。同一家系内の同一オスとメスから生まれた複数の個体について全ゲノム解析を行い、次世代シークエンサー（Illumina HiSeq X）によって平均５０リードのシークエンスを行う予定である。得られた塩基配列はアカゲザル（マカカ属）のアノテーションされたゲノム配列と比較され、疾患個体に特異的ゲノム配列の変化を明らかにしたい。ドルーゼン個体の黄斑部における電顕像からRPEの細胞間に間隙が生じていることから、これらを阻害する薬の効果について、変異体を強制発現しているRPE細胞とドルーゼン個体から得られたRPE細胞を用いて評価している。
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| Causes of Carryover |
平成２６年度で計画していたトランスジェニックマウスおよびノックインマウスの作製が平成２７年度に変更されたために、その実験費用を平成２７年度に繰り越した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
トランスジェニックマウスの作製はCAG（チキン・アクチン）プロモーターを用いてマウスのRosa26ローカスにZFN（Zinc Finger Nuclease）システムによって特異的に切断し、変異体を１コピー挿入することを計画している。それぞれの変異体を発現するマウスを交配させてヘテロザイゴスのマウスを作製する。ノックインマウスはCRISPR/Cas9システムによって特異的に切断し、カニクイザルの変異体に相当するマウスの遺伝子部位に遺伝子変異を片アリールづつ挿入し、トランスジェニックマウスと同様に交配して、ヘテロザイゴスのマウスを作製する。我々は何れの手法についてもすでに別の実験系で成功している。
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[Journal Article] Whole exome analysis identifies frequent CNGA1mutations in Japanese population with autosomal recessive retinitis pigmentosa.2014
Author(s)
Katagiri S, Akahori M, Sergeev Y, Yoshitake K, Ikeo K, Furuno M, Hayashi T, Kondo M, Ueno S, Tsunoda K, Shinoda K, Kuniyoshi K, Tsurusaki Y, Matsumoto N, Tsuneoka H, Iwata T.
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Journal Title
PLoS One
Volume: 9
Pages: e108721
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Novel C8orf37 mutations in patients with early-onset retinal dystrophy, macular atrophy, cataracts, and high myopia.2014
Author(s)
Katagiri S, Hayashi T, Yoshitake K, Akahori M, Ikeo K, Gekka T, Tsuneoka H, Iwata T.
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Journal Title
Ophthalmic Genetics
Volume: 12
Pages: 1-8
Peer Reviewed
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