ヒト歯髄幹細胞からのiPS細胞誘導の効率化・良質化の検討

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26293426
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 柴田 敏之 岐阜大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50226172)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 玉置 也剛 岐阜大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40585303) ; 飯田 一規 岐阜大学, 医学部附属病院, 助教 (30585237) ; 川口 知子(武田知子) 岐阜大学, 医学部附属病院, 医員 (30509815) ; 畠山 大二郎 岐阜大学, 医学部附属病院, 講師 (60377653) ; 石崎 明 岩手医科大学, 歯学部, 教授 (20356439)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: ヒト歯髄 / iPS細胞 / 良質化

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、我々が保有する豊富なヒトDPSCを用いて、iPS細胞誘導効率に差異のある細胞の比較および管理する酸素条件の違いによるiPS細胞の樹立効率の差異を利用し、「低酸素およびDLX4がiPS細胞誘導効率向上・良質化に関わる機序」を解析し、細胞初期化の基本的な知見を集積し『がん化しない良質なiPS細胞』を効率良く生み出す方策を得ることを目指している。その結果、iPS細胞誘導効率を支配する新たな因子(DLX4)は、高発現している細胞ないし強制発現させると誘導効率が有意に向上し、良質化（形態の整ったコロニーの出現）も得られることが示された。また、このDLX4はヒト歯髄細胞のみならず広くiPS細胞研究に用いられているヒト皮膚線維芽細胞でも同様の作用を示すことが示された（Science report 2014)。　DLX4は詳細について不明の部分も多いが、TGFβのシグナル伝達に関わることが示されて来ている。そこでTGFβ刺激下でiPS誘導を行った所、有意な誘導効率の低下を観察した。また、細胞間のsmadシグナルを調べた限りでは、差はなく、DLX4はTGFβシグナルの他の経路に関与している可能性を得た。さらに、低酸素条件でのiPS細胞誘導も効率化・良質化に有益であることを見い出した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究の期間内に明らかにすることとして、以下の３項目を大目標としている。

#1: DPSCのステムネス性の相違・変化（通常の継代培養によりステムネス性が喪失され、低酸素培養では維持される）によるDLX4の消長とiPS細胞誘導効率の変化を検討し、同一個体から得た細胞でもDLX4の消失と遺伝子導入による回復が図れるのかを明確にする。#2: iPS細胞誘導・分化誘導過程に於けるDLX4の消長を観察し、DLX4の必要性を明確化する。#3: DLX4高発現群と低発現群に於けるTGFβ刺激応答性（TGFβ受容体解析/シグナル分子解析/EMT変換解析）の相違を観察し、DLX4細胞初期化時の役割を明確にする。

このうちの＃１に該当する部分が、成果としてほぼ達成され報告にまで漕ぎ着けている。

Strategy for Future Research Activity

先に述べた、本研究の期間内に明らかにする、以下の３大目標である・・・・#1: DPSCのステムネス性の相違・変化（通常の継代培養によりステムネス性が喪失され、低酸素培養では維持される）によるDLX4の消長とiPS細胞誘導効率の変化を検討し、同一個体から得た細胞でもDLX4の消失と遺伝子導入による回復が図れるのかを明確にする。#2: iPS細胞誘導・分化誘導過程に於けるDLX4の消長を観察し、DLX4の必要性を明確化する。#3: DLX4高発現群と低発現群に於けるTGFβ刺激応答性（TGFβ受容体解析/シグナル分子解析/EMT変換解析）の相違を観察し、DLX4細胞初期化時の役割を明確にする。

この内の＃２、＃３について計画に沿って遂行する。この場合、TGFβシグナルの解析が大きなカギとなるのではないかと考えており、本年度はこれに傾注する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Conditioned medium of dental pulp cells stimulated by Chinese propolis show neuroprotection and neurite extension in vitro. (2015)
  • Author(s): Kudo D, Inden M, Sekine S, Tamaoki N, Iida K, Naito E, Watanabe K, Kamishina H, Shibata T, Hozumi I.
  • Journal Title: Neurosci Lett. 2015 Mar 4;589:92-7. Volume: 4 Pages: 589:92-7
  • DOI: doi: 10.1016/j.neulet.2015.01.035. Epub 2015 Jan 15.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The homeobox gene DLX4 promotes generation of human induced pluripotent stem cell (2014)
  • Author(s): Tamaoki N, Takahashi K, Aoki H, Iida K, Kawaguchi T, Hatakeyama D, Inden M, Chosa N, Ishisaki A, Kunisada T, Shibata T, Goshima N, Yamanaka S, Tezuka K.
  • Journal Title: Scientific Reports. 2014 Dec 4;4:7283 Volume: 4 Pages: 7283 e-pub
  • DOI: doi: 10.1038/srep07283
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Derivation of iPSCs after culture of human dental pulp cells under defined conditions (2014)
  • Author(s): Takeda-Kawaguchi T, Sugiyama K, Chikusa S, Iida K, Aoki H, Tamaoki N, Hatakeyama D, Kunisada T, Shibata T, Fusaki N, Tezuka K.
  • Journal Title: PLoS One. 2014 Dec 18;9(12):e115392 Volume: 18 Pages: e115392
  • DOI: doi: 10.1371/journal.pone.0115392. eCollection 2014.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] The homeobox gene DLX4 promotes generation of human induced pluripotent srem cells (2014)
  • Author(s): T.Tamaoki, K Takahashi, H Aoki, K Iida, T Kawaguchi, D Hatakeyama, M Indan, N Chousa, A Isisaki, T Kunisada, T Shibata, N Gotou, S Yamanaka, K Tezuka
  • Organizer: ASBMR（アメリカ骨代謝学会）
  • Place of Presentation: テキサス州ヒューストン
  • Year and Date: 2014-09-12 – 2014-09-16