2014 Fiscal Year Annual Research Report
歯髄幹細胞由来の新規抗炎症性マクロファージ誘導因子を用いた末梢神経再生療法の開発
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26293427
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
山本 朗仁 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (50244083)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
上田 実 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (00151803)
伊佐 正 生理学研究所, 発達生理学研究系認知行動発達機構研究部門, 教授 (20212805)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 神経再生 / 顔面神経 / マクロファージ / 炎症制御 / 瘢痕形成抑制 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
＜研究概要＞顔面神経損傷モデルに、新規M2MΦ誘導タンパク複合体; MCP－１とSiglec-9細胞外ドメイン(EDS-9)を投与し治療効果を検討。臨床研究用の製剤化に向けた基礎実験。
＜研究成果＞(1) 8週雌ラットの顔面神経を5mm切除した。MCP-1とEDS-9それぞれ10ngをコラーゲルに含浸し、留置、閉創した。処置後6週、PBS群では支配下領域のヒゲ運動が麻痺する。一方、治療群ではsham群と区別がつかないまでに運動機能が回復することを見出した。(2) MCP-1/EDS-9投与群で、投与後2ヶ月間、有害事象は観察されなかった。MCP-1とEDS-9を、それぞれ同時に1μg（１００倍量）投与しても有害事象は観察されなかった。(3) コントロール群に比べ治療群では、髄鞘を伴った末梢神経軸索が再生した。Sham処理群に比べ、再生軸索の直径は小さいが、軸索数は同等であった。(4) 逆行性神経トレーサーを切除部位より末梢側に投与すると、治療群で顔面神経核へ輸送されることから。治療介入により神経回路が再生したことが明らかとなった。(5) 定量的PCRにて、損傷部位のM１サイトカインの発現抑制、M２因子の発現上昇を確認した。炎症性組織損傷型環境が抗炎症性組織再生型環境に変換されたことが明らかとなった。(6) EDS-9制作用のプラスミド制作し、HEK293に遺伝子導入安定発現株を得た。培養液中にESD-9の分泌を確認。In vitro M2誘導能確認ずみ。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
平成２６年度の設定課題は、（１）顔面神経切断モデルへのMCP-１/レクチンB投与による病態改善の検討、（２）治癒メカニズムの検討であった。平成２７年度は、In vitro細胞培養系を用いた抗炎症性M２MΦと末梢神経再生メカニズムの解析を予定していた。当初の計画以上に進んでいると判断した理由は、研究実績が２６年度だけでなく、２７年度計画にまで踏み込んだものとなっているためである。以下に設定課題から見た実績評価について概説する。
平成２６年（１）行動試験で驚異的な治療有用性を確認した。コントロール群では瘢痕形成が著しく、軸索再生は観察されなかった。一方、２因子投与群では神経束の再生を確認した。再生した軸索は幼若であり細いが軸索数は未処理群と同等、軸索・髄鞘の厚み比率も未処理群と同じだった。トレーサー解析で神経回路の再生も確認した。（２）組織染色と遺伝子発現解析によって、損傷部位の環境が炎症性組織破壊型から抗炎症性組織再生型に変換されたことを確認した。
平成２７年度の予定研究であった神経細胞を使った研究を前倒しで行った。小脳顆粒細胞を採取し、神経毒で処理することで神経突起の伸長を抑制、細胞死を誘導した。これに２因子によって誘導したM２マクロファージの無血清培養上清を添加することで、神経突起の伸長が回復、さらに細胞死が完全に抑制されることを見出した。
これらの結果から、平成２６年度だけでなく２７年度の研究課題にも一定の解析結果が得られていることから、当初の計画以上に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
＜問題点＞現在、ヒト細胞株を使ってTAG付きEDS-9合成タンパクを制作している。臨床研究には「TAGなしEDS-9」をクロマトグラフィーで精製する必要がある。ESD-9の最終形態を確定することが急務である。
＜今後の課題＞(1) 上述のように、EDS-9の最終形態を早急に決定する。薬効はラット顔面神経切断モデルにおける神経機能改善効果、およびin vitroマウスM２MΦ誘導効果で評価する。（２）MCP－１とEDS-9の薬効を示す最小量を決定する。（３）非GMP/GLPレベルで安全性を検証する（血液検査、臓器ごとの組織解析）。（４）In vitroにおいて誘導したM2細胞の神経再生効果を検証する。（５）MCP-1/EDS-9を混和し一定期間後の活性を、in vitro M２MΦ誘導効果で評価する。製剤の安定性を確認する。（６）論文発表。
＜備考＞非GMP/GLPのMCP-1はバクテリアを使って制作する。EDS-9はplasmid vectorを使ってHEK293あるいはCHO細胞に遺伝子導入を行い、強制発現細胞を制作し、培養液から回収する。両タンパクともクロマトグラフィー精製を行う。
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| Causes of Carryover |
計画的に物品を購入・計画的に実験を実施した結果、経費の削減ができたため。神経再生因子MCP-1とESD-9のリコンビナントタンパク製造を予定していたが、平成２７年度に延期したため基金分を次年度使用とした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
歯髄幹細胞由来の新規抗炎症マクロファージ誘導因子を用いた末梢神経再生療法の研究研究実験を平成27年・28年も継続的に行い手法の開発・解明を目標とする。神経再生因子MCP-1とESD-9のリコンビナントタンパク製造を行う。
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[Journal Article] Secreted Ectodomain of Sialic Acid-Binding Ig-Like Lectin-9 and Monocyte Chemoattractant Protein-1 Promote Recovery after Rat Spinal Cord Injury by Altering Macrophage Polarity2015
Author(s)
Kohki Matsubara, Yoshihiro Matsushita, Kiyoshi Sakai, Fumiya Kano, Megumi Kondo, Mariko Noda, Noboru Hashimoto, Shiro Imagama, Naoki Ishiguro, Akio Suzumura, Minoru Ueda, Koichi Furukawa, Akihito Yamamoto
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Journal Title
Journal of Neuroscience
Volume: 35
Pages: 2452-2464
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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