2015 Fiscal Year Annual Research Report
頭蓋顎顔面領域高頻度疾患の原因究明から病態発症機序解明への最先端研究戦略
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26293436
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
田中 栄二 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 教授 (40273693)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井本 逸勢 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 教授 (30258610)
泰江 章博 徳島大学, 大学病院, 講師 (80380046)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / 遺伝子疾患 / 突然変異導入 / CRISPR/Cas |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成27年度はCRISPR/Casシステムの適用について、マウス１細胞期胚に対するマイクロインジェクション法だけでなく、エレクトロポレーション法の導入も試みた。その結果、遺伝子破壊の導入効率は両手法とも80%以上で、エレクトロポレーション法の方がサンプル処理速度が向上し、かつインジェクションにおける針の刺入回避による細胞の致死率減少が達成された。また、エレクトロポレーション法では、１本鎖DNAの共導入により、ノックインにも成功した。
一方、平成26年度に、多数歯欠損症患者より検出した、既知遺伝子（Msx1遺伝子）内の新規フレームシフト変異の疾患原因変異としての妥当性の検証実験を進めた。当科における多数歯欠損症患者から検出された新規変異は過去の報告中、最下流に認められた。その原因変異としての真偽を検証するため、同変異により欠失するC末端領域をCRISPR/Casシステムを利用してマウスで欠失させたところ、従来のノックアウトマウスで見られた歯の完全欠損や口蓋裂に起因する生後すぐの致死とは異なる表現型が得られた。すなわち、上顎第2臼歯の低形成ならびに第3臼歯欠損、下顎第2・第3臼歯、さらには下顎切歯の欠損が認められた（論文投稿中）。本表現型は、検出変異の疾患関連変異であることの妥当性を裏付けるばかりでなく、従来、in vitroの系でしか検討されてこなかったDNA deletion assayのin vivoへの発展性が示唆された。
脊椎動物におけるヒト疾患モデル動物の作製については、CRISPR/Cas切断領域前後の相同配列と疾患関連変異を含む一本鎖オリゴヌクレオチドの共導入により、ノックインマウス作製の系を構築した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
マウス1細胞期胚におけるCRISPR/Casシステムの適用を、マイクロインジェクション法だけでなくエレクトロポレーション法に拡大することで高効率化できた。さらに、小規模多数歯欠損症家系のターゲットリシーケンスから検出された既知遺伝子（Msx1）内の新規フレームシフト変異部位の下流ドメインを同手法にて欠失させたところ、歯の形成異常といった表現型が得られ、疾患関連変異であることをin vivo実験系にて検証ならびに証明した。また一方で、一本鎖オリゴヌクレオチドをエレクトロポレーションにてgRNAならびにCas9 mRNAと共導入することにより、過去に報告のある疾患関連点突然変異のノックインにも成功した。胚盤胞補完法における技術確立は現在検証中である。
以上より、平成27年度に予定した研究計画はほぼ実施できている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度に引き続き、検出変異のノックイン/アウトマウス作製を継続するが、遺伝子発現制御領域や染色体の一部が欠失するような変異を検出した際には、同制御領域のマウスゲノム相当配列を欠失させるゲノム編集マウスを作製することで、in vivo機能解析も実施する。 作製したノックイン/アウトマウス胚やその切片における形態学的・組織学的観察に加え、in situ hybridization、免疫組織化学染色による形態形成関連因子の発現解析を行い、野生型との相違を検索する。
さらに、変異ごとのアノテーション付けによる診断体系の構築として、患者表現型と検出変異、またそれらのin vitro、in vivo解析から蓄積されたデータを基盤とし、変異ごとのアノテーション付けを行う。本研究解析過程によるアノテーション付けは、これまでに多く試みられてきたgenotype-phenotype correctionの追及に終わらず、近い将来実施される予定の、遺伝子診断における正しい診断体系構築の礎となりうる。
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| Causes of Carryover |
研究成果の発表が一部、次年度に持ちこされたため、旅費の合計が減ってしまった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成28年度に研究成果発表のための学会参加が増える。
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[Presentation] Study of Pax6-deficient mosaic mice generated by the CRISPR/Cas system.2015
Author(s)
Akihiro Yasue, Hitomi Kono, Tetsuya Bando, Yoshiyasu Ishimaru, Junji Inoue, Takahiro Watanabe, Seiichi Oyadomari, Sumihare Noji, Taro Mito, Hideyo Ohuchi, Eiji Tanaka
Organizer
第48回日本発生生物学会
Place of Presentation
つくば国際会議場（茨城県つくば市）
Year and Date
2015-06-02 – 2015-06-05
