2016 Fiscal Year Annual Research Report
Research strategy for identification of the pathogenesis of the common structural abnormalies in craniomaxillofacial region
| Project/Area Number |
26293436
|
|---|
| Research Institution | The University of Tokushima |
|---|
Principal Investigator |
田中 栄二 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 教授 (40273693)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井本 逸勢 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 教授 (30258610)
泰江 章博 徳島大学, 大学病院, 講師 (80380046)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| Keywords | ゲノム編集 / 遺伝子疾患 / TALEN / CRISPR/Cas |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、頭蓋顎顔面領域の形態形成に影響を及ぼす原因遺伝子不明の疾患をターゲットに、次世代シーケンサーを用いた解析を柱に原因遺伝子探索を行い、新規原因遺伝子を同定すると共に、人工ヌクレアーゼによる同定変異部位の機能解析から、病態形成機序を解明することを目的とした。
非症候性多数歯欠損症家系の唾液サンプルからゲノムDNAを抽出し、歯牙欠損症の原因遺伝子の全てのエクソンのシーケンスを行ったところ、Msx1遺伝子のエクソン2にフレームシフト変異を検出した。マウスMsx1遺伝子配列中、変異検出部位近傍に標的配列を設定し、マウス１細胞期胚においてマイクロインジェクションにてCRISPR/Casシステムを適用した。胎生16.5日に胚を摘出し、Msx1ノックインマウス様表現型の確認、ならびに標的配列のシーケンスを行った結果、過去に報告のないフレームシフト変異がMsx1の3’末端領域に検出された。本変異はMsx1遺伝子最下流のMH6領域に影響を与えるため、同領域の5’側にgRNA標的配列を設定し、マイクロインジェクション法によるCRISPR/Casシステムを適用し、胎生16.5日に胚を摘出したところ、12胚中6胚で口蓋裂ならびに歯の発生異常を認めた。
さらに、多数歯欠損症患者より検出した、既知遺伝子（Msx1遺伝子）内の新規フレームシフト変異の疾患原因変異としての妥当性の検証実験を行った。同変異により欠失するC末端領域をCRISPR/Casシステムを利用してマウスで欠失させたところ、上顎第2臼歯の低形成ならびに第3臼歯欠損、下顎第2・第3臼歯、さらには下顎切歯の欠損が認められた。
脊椎動物におけるヒト疾患モデル動物の作製については、CRISPR/Cas切断領域前後の相同配列と疾患関連変異を含む一本鎖オリゴヌクレオチドの共導入により、ノックインマウス作製の系を構築した。
|
| Research Progress Status |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
|
| Strategy for Future Research Activity |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
|
| Causes of Carryover |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
|
