2014 Fiscal Year Annual Research Report
緯度の異なるN2O放出ホットスポットでの窒素循環要因の探査と環境修復生物資源調査
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26304042
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
橋床 泰之 北海道大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (40281795)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宮本 敏澄 北海道大学, (連合)農学研究科(研究院), 講師 (00343012)
小林 真 北海道大学, 北方圏フィールド科学センター, 助教 (60719798)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 亜酸化窒素生成細菌 / N2O放出ホットスポット / N2O消去微生物 / N2O生成抑制生物 / 脱窒抑制 / 無機窒素代謝制御 / 現地優占植物 / 緑肥作物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
亜酸化窒素（N2O）放出能の高い細菌種が出現することにより，当該生態系における窒素循環の制御システムがどのような特徴を示すように変動するか，またその変動を制御する主要因が何かを明らかにするため，低緯度N2O生成ホットスポットとして知られる熱帯泥炭開墾土壌，中緯度では北海道黒ボク畑地土壌，高緯度では亜北極湿地，それぞれから卓越したN2O生成能を示す細菌やN2Oを高効率で消去する微生物を分離・探索し，それらのN2O生成鍵遺伝子や他の無機窒素代謝遺伝子の解析を試みた。また，それらの現地植生の優占植物種やそれらに共生する菌根菌類が，そのような無機窒素代謝に卓越した能力を発揮する土壌微生物の活動をどのように制御･あるいは利用しているかについて，植物と土壌／根圏微生物の植物二次代謝産物を介した生物間相互の視点から検討した。土壌微生物群集からのN2O消去微生物のスクリーニングには，検索対象となる微生物を単独で接種した0.5~5 mMのKNO3を基質および窒素源として含む10 mLジェランガム培地のヘッドスペースに5~3000 ppmvのN2Oガスを添加し，その消長を5日間に亘ってモニタリングした。また，黒ボク土壌と熱帯泥炭地開墾土壌からそれぞれ分離したPseudomonas属とBurkholderia属のN2O生成細菌2種を被検菌株とした，N2O消去微生物のN2O生成抑制効果を調べた。その検定には，N2O放出細菌とN2O消去微生物を上記培地に共接種し，培養後の菌体比率や菌体密度を記録した上でN2O生成量の抑制効果を評価した。一方，植物では，検索対象とした11種類の緑肥植物や穀物の種子をそれぞれガスクロバイアル中で芽生えさせ，その後，その根圏にN2O放出細菌を一定菌体量接種し，対照区に比べてN2O生成が亢進／抑制されるものを検索した。活性を示す場合は，芽生えの根抽出物や根滲出物中に類似の効果を検索した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
低緯度N2O生成ホットスポットとして知られる熱帯泥炭開墾土壌からトラッピングカルチャーを経て得た細菌分離株に，極めて強力なN2O消去能を示すものを見出した。ヘッドスペースに3000 ppmvのN2Oガスを注入したガスクロバイアル内のジェランガム培地に菌株を接種したところ，3000 ppmvのN2Oガスを3日以内に完全消去する極めて強力なN2O消去株を見出したため，その全ゲノム解析を行った（属は同定済み，文献未記載の新種と推定される）。中緯度の北海道黒ボク畑地土壌では，多くのN2O放出Pseudomonas属細菌からN2O還元酵素遺伝子であるnosZが検出されないことから，N2O還元酵素遺伝子の不活性化と欠落が高頻度で起こっている可能性が示された。また，nosZが残るもののその機能低下が著しいPseudomonas属完全脱細菌を数株得た。高緯度では亜北極湿地から特に中性域（pH 6.0-7.0）で卓越したN2O生成能を示す細菌株を分離し，16S rRNA遺伝子塩基配列の相同性検索から，これをPseudomonas属細菌と同定した。また，アンモニア酸化に関わる好中温性Thaumarchaeota門古細菌の高頻度での出現を高緯度ツンドラや森林限界線付近の土壌で確認した。また幾つかの外生菌根菌類を現地で採取し，これを純化後，継代培養することに成功した。さらに現地で採取した幾つかの優占植生（デントコーン，ガンコウラン，蘚類，地衣類等），緑肥植物6種，ならびに穀物5種について，それぞれの種子から調製した芽生えを用い，無機窒素代謝制御に関わっているものを探索した。その結果，ヘアリーベッチに弱いN2O生成抑制効果，ハツカダイコンに強力なN2O生成亢進効果が認められた。次年度につながる研究対象資材を数多く見出すことができたため，初年度としての目的は，概ね達成された。
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| Strategy for Future Research Activity |
熱帯泥炭開墾土壌から見出した極めて強力なN2O消去細菌については，その遺伝子解析からN2O消去に重要な役割を果たす遺伝子を特定しつつあるが，その分布が各ホットスポットの微生物群集にも存在しているか否かを検証する。また，中緯度の北海道黒ボク畑地土壌から分離されたN2O還元酵素機能低下が著しいPseudomonas属完全脱細菌からnosZの塩基配列全長を決定し，その配列の特徴に類似したnosZ変異が他のホットスポットでも起こっているか否かを検証する。さらに，亜北極湿地のムラサキミズゴケから分離し，Pseudomonas属細菌と同定した強力なN2O生成細菌が弱酸性域で急激にN2O放出能を低下させている理由を解明する。また，アンモニア酸化に関わる好中温性Thaumarchaeota門古細菌の現地ハビタートにおける棲息密度と棲息ニッチをfluorescence in situ hybridization (FISH) 解析によって明らかにする。これらホットスポット近傍または関連するエコシステムに優占する真核生物がN2O放出に代表される不完全な無機窒素代謝の抑制に関わっているかどうかを生理活性物質のアッセイ法を参考にして広く探索する。ハツカダイコンには強力なN2O生成亢進効果が認められているため， 同様の手法でSphagnum capillifolium （ムラサキミズゴケ）の二次代謝産物についても検討する。これらデータから，N2Oホットスポットにはまだ未知の無機窒素代謝能を独自に発達させた生物資源が存在すると考えられることから，今年度もスカンジナビアとマレーシア・サラワクへ現地調査に入り，現地の研究協力者と協働でN2O抑制への応用が有望な生物資材の発掘に務める。
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| Causes of Carryover |
謝金を支払うことで研究補助のアルバイトを予定していた学生が，私的な都合により長期学外に留まったためその謝金分の使用を留め置いた。年度末時点では，アルバイトを継続するか否かの意思を確認することができずにいた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
2015年4月からのアルバイト継続を断ってきたため，4月からは物品費に繰り入れ，これを使用する予定である。
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