2014 Fiscal Year Annual Research Report
農耕地における窒素循環の駆動力―微小環境でリンクする硝化と脱窒
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26310315
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| Research Institution | National Institute for Agro-Environmental Sciences |
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Principal Investigator |
早津 雅仁 独立行政法人農業環境技術研究所, その他部局等, 研究員 (70283348)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
多胡 香奈子 独立行政法人農業環境技術研究所, その他部局等, 研究員 (20432198)
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| Project Period (FY) |
2014-07-18 – 2017-03-31
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| Keywords | 硝化 / 脱窒 / 団粒 / 微小環境 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本課題では、有機物が供給される土壌表層や有機物の微小な環境に生じる好気・嫌気環境とその混在領域で多様な微生物の相互作用により好気的反応硝化と嫌気的反応脱窒が同時に進行する独自の反応システムを形成するメカニズムを明らかにすることを目的とする。
本年はDNA抽出に必要な土壌量を検討し、これと並行して研究対象とする土壌とそこで機能する硝化菌と脱窒菌の多様性について検討した。また各農家の圃場レベルの硝化菌（アンモニア酸化菌）の多様性についても、微量試料の解析方法の参考とするために検討した。
土壌40mgからDNAを抽出することができた。粒径の異なる団粒（0.4g）からDNAを調製しPCR-DGGEでアンモニア酸化細菌のamoA（アンモニアオキシゲナーゼサブユニットA）を解析したところ粒径の異なる団粒集団でamoAの多様性に差はなかった。一方各農家レベルのamoAのコピー数を定量PCRで多様性を次世代シーケンサーで解析したところ、amoAの多様性には土壌pHが最も大きな影響を及ぼすことが明らかになった。今後はpHの異なる微量土壌を対象とすることとした。これまでに特定したN2O発生量の多い土壌表層における脱窒菌の多様性と実際に機能する脱窒菌を明らかにするために、土壌コア培養実験を行いN2O発生土壌の脱窒関連酵素（亜硝酸還元酵素と亜酸化窒素還元酵素）のDNAとmRNAを定量PCRで存在量を次世代シーケンサーで多様性を解析し実際に機能する脱窒菌は全体の一部であり異なる脱窒系酵素が補完して脱窒を担うことを示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年はDNA抽出に必要な土壌量を検討し、これと並行して研究対象とする土壌を選択しそこで機能する硝化菌と脱窒菌の多様性を調べた。さらに各農家の圃場レベルの硝化菌（アンモニア酸化菌）の多様性についても、微量試料の解析結果の解釈の参考とするために調査した。
各項目について当初計画している実験を実施し目的の成果を得た。具体的には下記に示した。
１）微量の土壌からビーズビーティング法で分析可能な量のDNAを調製できることがわかった。
２）粒径の異なる団粒集団（0.4g）間においてamoAの多様性にはほとんど差がないことをPCR-DGGEで示した。一方、農家の圃場におけるamoAのコピー数の定量と多様性解析から、アンモニア酸化細菌の多様性には土壌pHが最も大きな影響を及ぼすことが明らかになった。
３）脱窒は複数の脱窒菌の代謝系が組み合わさって形成されていることがわかった。
以上、計画通りに進捗している。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究対象の土壌中に存在するアンモニア酸化細菌、アンモニア酸化古細菌および脱窒菌の多様性や菌数の解析を進め、微量の土壌からDNAを調製する方法について検討し目的に向けて研究が進展した。N2Oの同位体分析（アイソトポマー分析）などと組み合わせて、硝化と脱窒のリンクの解明に向けて研究を推進できる。今後はメタゲノム解析に加えて、実際に土壌で機能する硝化菌や脱窒菌の分離も視野に入れ、環境DNAとRNA、純粋分離菌（あるいは集積培養菌）、同位体分析という3方向から微小環境における硝化と脱窒の関係の研究を進める予定である。
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| Causes of Carryover |
培養実験などに時間を要しまた次世代シーケンサーの故障の修理に7ヶ月を要したため、次世代シーケンサーの稼働回数が予定よりも少なかった。また途中から微生物の分離にも着手したため、遺伝子解析等が次年度にまたがることになった。以上によりの高額試薬の使用が次年度にずれ込んだ。このため平成26年度分の予算執行が予定より少なく次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成27年度は、環境DNAとRNAさらには分離菌ゲノム解析などを実施するため次世代シーケンサーを多数回稼働する。また分析する土壌サンプルが大幅に増え、これらからRNAやDNAの抽出するために高額試薬の使用が多くなる予定であり、これらにかかる経費を支出する。また一連の遺伝子解析作業では、熟練のテクニシャンを雇用し、効率的に実験を進めるために、賃金を支出する予定である。以上により適正な予算執行を計る。
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Research Products
(1 results)
