2014 Fiscal Year Research-status Report
計算と実験の融合によるＤＮＡ結合タンパク質の塩基配列選択能の高度化
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26330339
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| Research Institution | Japan Atomic Energy Agency |
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Principal Investigator |
河野 秀俊 独立行政法人日本原子力研究開発機構, 原子力科学研究部門 量子ビーム応用研究センター, 研究主幹 (40291918)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 生体生命情報学 / DNA結合蛋白質 / B1H / 分子設計 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
遺伝情報の発現は、DNA結合蛋白質が特定の塩基配列に結合することによって制御されているが、その塩基配列特異性は蛋白質によって様々である。また、次世代シークエンサーによるChIP-seq 解析により、転写因子などDNA結合蛋白質がゲノムのどこに結合しているかを網羅的に調べることができるようなってきた。しかし、依然として蛋白質がどのようにDNAを認識しているかはよく分かっていない。そこで、本研究では、蛋白質を設計し、DNAとの結合を実験的に調べることにより、その認識メカニズムの解明に迫る。
本年度は、設計した蛋白質がどのような塩基配列にどの程度の親和性で結合するか調べるための実験系の確立を行った。
あらかじめ想定した塩基配列との結合のみを調べることでは、結合選択性を調べることができない。そこで、ランダム塩基配列の中から結合する塩基配列をスクリーニングできる方法、B1Hアッセイを用いることとした。ターゲットとする蛋白質のB1Hアッセイの系の確立に時間を要したが、最終的に大腸菌とオリゴDNAの混合比を最適化することにより、スクリーニングの系を確立することができた。
また、ゲルシフトアッセイにより、DNA結合蛋白質のリンカー部分のアミノ酸長の最適化も行った。以上、DNAの認識特異性を検証する実験系の確立ができた。
一方、シミュレーション計算では、DNAの塩基配列に依存したダイナミクスの性質とDNA結合蛋白質の結合部位に相関があることを見出した。さらに、その相関は細胞種によって変わり、特にDNA結合蛋白質が結合する周辺部位のDNA配列のダイナミクス特性が変わることが見出された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
参考文献に記されていないDNA結合蛋白質でB1H法のスクリーニングがうまく働かず、開発者に問い合わせるなど、その原因の特定に時間を要した。結果、大腸菌とオリゴDNAの混合率に問題があることがわかり、最終的に系を確立することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
コンピュータを使った分子設計により、DNA認識に関わっている残基を改変し、DNA結合蛋白質の結合特異性を変える。この際、以下の2つに注目して改変を行う。
１）塩基と直接的な相互作用をしているアミノ酸残基（直接認識）を親和性ポテンシャルに基づき評価し、DNA側、アミノ酸配列側それぞれの改変を行う。
２）塩基と直接結合していないがDNAコンタクトしているアミノ酸残基（DNAの形状認識）に注目し、DNA形状やダイナミクスと近傍に位置するアミノ酸残基の相関解析を行う。その結果にもとづきDNA側、アミノ酸配列側それぞれの改変を行う。
1),2) の結果をB1Hアッセイ、ゲルシフトアッセイにより検証する。
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| Causes of Carryover |
概ね、計画通りの施行であった。雇用する実験補助者によって多少の人件費算定額が変わるため、学会の参加を見送った。結果、差額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度の人件費と実験消耗品の購入に充てる。
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