脂肪細胞とマクロファージ共培養時における酪酸のエイコサノイドと脂質代謝への影響

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26350166
• Research Institution: Kobe Gakuin University
• Principal Investigator: 大平 英夫 神戸学院大学, 栄養学部, 講師 (40351762)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 短鎖脂肪酸 / Butyrate / 脂肪細胞 / マクロファージ / プロスタグランディンE2 / Lipolysis

Outline of Annual Research Achievements

[目的]脂肪細胞とマクロファージ間の相互作用には代謝性疾患と深い関連性がある。以前、我々は、脂肪細胞とマクロファージの共培養にてlipolysisによる遊離脂肪酸(FFAs)放出が、酪酸ナトリウム(Bt)添加により、有意な抑制を示すことを報告した。Btは、様々な細胞においてプロスタグランディンE2(PGE2)産生を増加させることが知られている。そこで我々は、共培養下にて、BtがPGE2を増加させ、これがlipolysis抑制作用と関連性を持つかどうかについて調査を行った。[研究計画] 直接、または間接共培養法の条件下、分化3T3-L1と RAW264.7細胞を用い、Bt添加による培養液中PGE2産生量を測定、その機序について調査を行った。加えて、PGE2がlipolysisにどのような影響を与えるか、特にPGE受容体とその経路への作用について調査を行った。
[結果]脂肪細胞、マクロファージ単独では増加しない培養液中のPGE2は、共培養により有意な増加を示し、Bt添加は、0.2 mM以降でさらに有意な増加を示した。共培養では、両細胞共に細胞内シクロオキシゲナーゼ-2発現レベルがmRNA、タンパク質レベルで増加を示し、Btの添加でさらに発現レベル増加を認めた。共培養下において、マクロファージはcytosolic PLA2活性増加を認め、脂肪細胞では、adipose specific PLA2の発現増加が認めた。Bt添加により、マクロファージのcPLA2は有意な増加を示した一方、脂肪細胞のAdPLA2発現には変化は無かった。共培養下で増加した、培養液中のFFAsは、BtもしくはPGE2添加によりlipolysisの抑制が認められ、PGEレセプター3阻害薬の添加によりPGE2処理のFFAs量はコントロールレベルまで低下、Bt処理では、完全ではなく、部分的なFFAsの低下を示した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の仮説通り、共培養条件にて増加を示すPGE2は、酪酸ナトリウム(Bt)添加により、さらに増加を認め、増加したPGE2が脂肪細胞へのlipolysisを抑制していることが示唆された。その機序も未解明な点も多々あるが、PGEレセプター3経路を介した機序が関連することを示唆する実験結果を得ている。
研究期間内に明らかにすべき内容の4点中、不完全ではあるが3点の要めとなる結果を得ている。
Ⅰ：培養液中 PGE2産生量の評価
Ⅱ：脂肪細胞、マクロファージのエイコサノイド代謝酵素 mRNAと蛋白質発現レベル評価
Ⅲ：PGE2産生量変化と、脂肪細胞内TG代謝の関連性評価

Strategy for Future Research Activity

今後、共培養下、酪酸ナトリウム(Bt)添加により増加したPGE2がlipolysis抑制に影響している仮説をより強く証明するには、現時点では未だ曖昧な点が複数存在する。それ故、これらを補完するための実験を継続する予定である。
１．PGEレセプター3阻害薬を用いた実験への追加実験として、COX-2阻害薬を用いた実験を行う。
２．脂肪細胞のlipolysisに関与するNF-κB/TNF-α経路を阻害した条件での、Bt, PGE2のlipolysis評価を行う。
３．cPLA2, AdPLA2に加え、secretory PLA2(sPLA2)に対するBtの影響について評価を行う。
４．脂肪細胞へのlipolysisに作用する複数のリパーゼ発現量変化について評価を行う。

Causes of Carryover

次年度の計画は、以下の4点について実験を行う。
１．PGEレセプター3阻害薬を用いた実験への追加実験として、COX-2阻害薬を用いた実験を行う。２．脂肪細胞のlipolysisに関与するNF-κB/TNF-α経路を阻害した条件での、酪酸ナトリウム(Bt), PGE2のlipolysis評価を行う。３．cPLA2, AdPLA2に加え、secretory PLA2(sPLA2)に対するBtの影響について評価を行う。４．脂肪細胞へのlipolysisに作用する複数のリパーゼ発現量変化について評価を行う。

Expenditure Plan for Carryover Budget

１,４．COX-2選択的阻害薬、もしくはBt存在下による脂肪細胞内TG代謝の評価について：共培養条件（間接法）：COX-2, Bt添加後のlipolysisならびに、脂肪細胞Acetyl CoA carboxylase (ACC)、Adipose triglyceride lipase (ATGL)、Hormone sensitive lipase (HSL)、 Cidec（FSP27）、 Perilipin 、lipoprotein lipase (LPL) mRNA、蛋白質レベルの変化をreal-time PCR法, Western Blot法により検出。２．TNF-α刺激時、NF-κB選択的阻害薬、抗TNF-α抗体、Bt、COX-2選択的阻害薬存在下での脂肪細胞lipolysis効果の評価について：培養液中の遊離脂肪酸(FFAs)濃度の定量。３．共培養条件（間接法）：マクロファージ、脂肪細胞それぞれの細胞内 s PLA2 mRNA、蛋白質発現レベルの変化をreal-time PCR法, Western Blot法により検出。sPLA2の細胞内総酵素活性について測定。

Remarks

本研究の中間報告として、2015年7月9日～10日に実施される”第47回日本動脈硬化学会総会・学術集会”にて既に演題登録を行っており、ポスター発表する予定となっている。
＊演題採用の連絡は5月中旬の予定。