2014 Fiscal Year Research-status Report
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26350251
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| Research Institution | Setsunan University |
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Principal Investigator |
尾山 廣 摂南大学, 理工学部, 教授 (50221700)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
杉村 順夫 公益財団法人衣笠繊維研究所, その他部局等, その他 (20273542)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 細胞呼吸 / ミトコンドリア / 蛍光染色 / 核 / 発酵 / エネルギー / 酵母 / ストレス応答 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. 嫌気及び好気条件下における酵母の培養
嫌気培養には10ｍL容のシリンジとシリンジキャップを用いた。乾燥酵母を種菌に、YMG液体培地5ｍLに初発のOD600が約1になるように植菌し、30℃で50時間培養したところOD600は約5となった。なお、二酸化炭素の発生量はシリンジの目盛りから測定した。一方、好気培養には、ガラス試験管(φ2.8cm×20cm)を用いた。乾燥酵母を種菌に、YMG液体培地5ｍLに初発のOD600が約1になるように植菌し、30℃、120 rpmで50時間培養したところ、OD600は約14となった。
2. ATP測定
好気または嫌気条件で培養(30℃、120 rpm、1週間)後の培養液のATP濃度をルミテスターで測定したところ、好気のATP濃度は嫌気のそれに比べて8.4倍高い値となった。なお、このときの菌体数はOD600値で合わせた。教科書の理論値は19倍であるが、実測値との間に差がみられた。また、授業時間を想定した2時間の培養では好気と嫌気条件のATP濃度がほぼ同じ値となった。
3. ミトコンドリアと核の染色
好気の培養液(OD600=13.84) 10μLに、10μM のMitoTracker Greenを190μL加えて振とう処理した(30℃、120rpm、15分間)。一方、嫌気の培養液(OD600=5.05) 27μLに、10μMのMitoTracker Greenを173μL加えて振とう処理した。なお、振とう中は試験管をアルミ箔で覆って遮光した。15分間の振とうにより、好気または嫌気によらずMitoTracker Greenでミトコンドリアが染色された。同様に、DAPIで核を染色しても良好な結果が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
嫌気条件でのアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)の可視化実験が未着手である。研究実績に示した好気及び嫌気条件でミトコンドリアの蛍光染色を行ったが、それぞれのイメージング像を比較してもミトコンドリアの形状や数的変動及び分布変動に有為な差が認められなかった。一方、酵母の増殖とATP濃度には有意な差が見られていたことから、嫌気条件が予想していた結果を出すのに不十分な状態である可能性が高いと考え、嫌気条件の実験系を再検討後、ADHの可視化実験を開始することにした。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成26年度に予定していた「細胞呼吸のバイオイメージング」のうち、嫌気実験系の構築が未完成となった。この原因は、上述したように、不十分な嫌気状態であったのか、LED蛍光顕微鏡の分解能に起因するものと考えられる。高校で実施することを考慮し、教科書に記載のあるシリンジを使って嫌気条件を再現したが、この一連の操作では嫌気状態が不十分であった可能性がある。そこで、温度(20℃、25℃、30℃、35℃)及び培養時間(2時間、4時間、8時間、18時間、24時間、48時間)について、ｷｭｰﾈ氏発酵器で二酸化炭素の発生量を同時にモニターしながら、シリンジを用いた実験系を再検討する。早急に、「細胞呼吸のバイオイメージング」を完成後、アポトーシス誘導による細胞ストレス応答の実験に着手する。
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| Causes of Carryover |
摂南大学の会計システムは２月から３月まで物品を購入できない。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
出来るだけ早い時期に購入計画を立て実験を準備するように努力するが、生き物を対象とする実験では予定通りに進まないこともあるため、会計システムの改善も望まれる。
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