2014 Fiscal Year Research-status Report
伸展変形挙動のその場観察による細胞内力学場評価と細胞骨格リモデリングの動態解明
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26350503
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
佐藤 克也 徳島大学, ソシオテクノサイエンス研究部, 講師 (10403651)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
南 和幸 山口大学, 理工学研究科, 教授 (00229759)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 細胞バイオメカニクス / メカノトランスダクション / MEMS / ストレッチ刺激 / 骨芽細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成26年度には，伸展刺激を受ける細胞の高精度その場観察を可能とするために，細胞伸展マイクロデバイスの改良を行った．これまでには，マイクロデバイスにビルトインされたスライダー機構を用いてデバイスを駆動していたが，その方式を改め，マイクロマニピュレーターとマイクロニードルを用いてデバイスのアームを直接駆動する手法を採用した．その結果，伸展刺激付与時の顕微鏡焦点方向への剛体変位を大幅に抑制することに成功した．この改良によって，これまでは不可能であった，伸展刺激を受ける細胞の高時間・空間分解能でのその場観察を達成した．
細胞伸展マイクロデバイスの改良を受けて，実際に伸展刺激を受ける細胞の細胞内力学場評価を行うための観察画像データ取得へと移行した．しかしながら，当初予定していたアクチン細胞骨格の蛍光標識手法が，想定よりも大幅に遺伝子導入効率が低いことが判明した．そのため，当初予定していた市販のバキュロウィルスを用いたアクチン蛍光タンパク質遺伝子導入系ではなく，プラスミドDNAを用いたLifeact-蛍光タンパク質の遺伝子導入系を採用することとした．
計画変更に伴い，Lifeact-TagGFP2プラスミドDNAを骨芽細胞様細胞MC3T3-E1に導入するための条件検討を新たに行う必要が生じた．そこで，年度後半には，リポフェクション試薬の選定，および遺伝子導入条件の検討を行い，高効率での遺伝子導入条件を明らかにした．平成26年度中に遺伝子導入条件の検討がほぼ完了したため，平成27年度からは，ライブセルイメージングによる伸展刺激を受ける細胞の変形動態観察に移行する予定である．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成26年度に計画していた，細胞伸展マイクロデバイスの改良によるピントずれの抑制および高精度でのその場観察が達成されたため，当初の目的である，伸展刺激を受ける細胞の変形動態のその場観察に目処がたった．この点については計画通りに達成できたと評価できる．
その一方で，アクチン細胞骨格の可視化に用いる予定であった蛍光タンパク質遺伝子導入系が，当初の想定を大幅に下回る遺伝子導入効率であったため，他の方法を採用する必要があった．そのために，当初計画していなかった，遺伝子導入のための条件検討が必要となった．この点については若干の計画の遅れを生じさせた．しかしながら，大体として採用した遺伝子導入系についても，条件検討が完了したため，全体としては概ね順調に進展していると評価できる．
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| Strategy for Future Research Activity |
遺伝子導入による，アクチン細胞骨格の蛍光標識に目処がたったので，伸展刺激を受ける細胞の高時間・空間分解能でのライブセルイメージングへと段階を進める．また，細胞の変形動態を捉えた画像データを取得した後の解析手法についても検討を開始する．現状では，画像相関法を用いたひずみ分布計測を予定している．
当初の計画では，市販の蛍光標識タンパク質遺伝子導入系を用いて，アクチン細胞骨格および焦点接着斑の可視化を計画していたが，この遺伝子導入系の導入効率が想定を大幅に下回ったため，蛍光タンパク質による可視化はアクチン細胞骨格のみとし，代わりに蛍光染色による細胞膜の可視化を採用する予定である．
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| Causes of Carryover |
細胞培養に用いる消耗品および薬品として計上していた計画費用に対して，実際に購入に要した金額が少なかったために差額が生じた．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
差額により生じた次年度使用額は，細胞培養に用いる消耗品および薬品を購入するための金額としては，比較的少額であり，次年度の使用計画においても生じると予想される変動金額内である．したがって，使用用途の変更は行わずにこのまま消耗品および薬品の購入に充てる予定である．
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