2014 Fiscal Year Research-status Report
リモデリング進行解明に向けた伸展負荷時の肺胞上皮細胞の構造と機能変化に関する研究
| Project/Area Number |
26350505
|
|---|
| Research Institution | Kyushu University |
|---|
Principal Investigator |
世良 俊博 九州大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (40373526)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
工藤 奨 九州大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (70306926)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| Keywords | 肺上皮細胞 / 伸展刺激 / 細胞骨格 / 蛍光観察 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
酸素や二酸化炭素のガス交換は，気道を通過し，肺胞部においてのみ行われる．肺胞は，膨張と収縮を繰り返して呼吸活動を行い，この際に，実質的な機能を担う肺胞上皮細胞には，常に大きな伸展負荷が生じる．この肺胞上皮細胞は，伸展負荷に対して多様な物質を分泌して機能を保っている．
肺疾患では，伸展負荷による細胞損傷や分泌能変化が問題である．肺胞上皮細胞へ伸展刺激を加えると，細胞の損傷促進，分泌能の一部喪失などが報告されている．一方で，肺胞上皮細胞は自身の損傷を防ぐために伸展に対して，細胞自身が細胞骨格構造をリモデリングさせることで形態変化する．従来研究により，肺胞上皮細胞の形態変化と分泌能に関係があることが示唆されているが，形態変化時の細胞骨格の変化は詳しくわかっていない．肺胞上皮細胞に対して様々な伸展を与えた際の細胞骨格の変化を観察することにより，分泌能と伸展の関係を得る手がかりになると考えられる．
まず，肺胞上皮細胞（Ａ５４９細胞）をポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）膜上に培養し，異なる時間，大きさの伸展を負荷し，形態維持に重要な細胞骨格の一つであるFアクチン繊維を蛍光観察した．アクチンは，ファロイジン染色により蛍光標識した．その結果，伸展刺激を負荷した場合の肺胞上皮細胞のFアクチンでの繊維構造が変化した．
その後肺胞上皮細胞（Ａ５４９細胞）にpAcGFP-Actinを遺伝子導入し，伸展を負荷した際のアクチン繊維のライブイメージングを試みた．遺伝子導入にはリポフェクション法を用い，伸展を負荷した際の蛍光タンパク質を観察した．
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は培養細胞に伸展刺激を負荷できる装置を作成した．本伸展刺激装置は，顕微鏡にマウントできる本体とコントローラーから構成されている．本体には２つのステッピングモーターがあり，細胞を培養したＰＤＭＳ膜製のチャンバーを左右に引っ張ることにより，できるだけ観察領域を見失わないように伸展刺激を負荷できるように設計した．またコントローラーには，プラグラムを作成することによりＰＤＭＳ上に培養した細胞に任意に伸展刺激を加えることが可能である．実験では，ＰＤＭＳ膜上に肺胞上皮細胞（Ａ５４９細胞）を培養し，伸展刺激を加えた．
次に伸展刺激と細胞骨格の関係を調べるために，アクチンをファロイジン染色により蛍光標識し，伸展刺激とアクチンの構造変化を観察した．さらにライブイメージングを行うためにpAcGFP-Actinを遺伝子導入し，伸展刺激の際のアクチンの変化を観察した．本手法は細胞内たんぱく質PKCの観察にも応用が可能である．
以上の理由から，実験はおおむね順調に進展している．
|
| Strategy for Future Research Activity |
まず，肺胞上皮細胞の炎症反応テストを行う．従来研究によると肺胞上皮細胞にナノシリカ粒子を約5時間暴露する方法が提案されているが，本手法の確認を行いさら他の方法も検討する．細胞が炎症を起こすと、細胞内の活性酸素種（reactive oxygen species, ROS）が増加することが知られており，ROSのイメージングには、ジクロロフルオレセインジアセテート（DCFH-DA）を用いてレーザー顕微鏡で観察し，炎症反応を確認する．また、ファイロイジンで細胞を染色し、アクチンチンフィラメントの変化も観察する．
また，肺胞上皮細胞と血管内皮細胞の共培養の検討を行う．本課題は、共培養系での微粒子の透過性を評価することが最終目標であるが，そのためには，厚さ２０ミクロン程度の多孔質ＰＤＭＳ膜を作成しそれを挟んで肺胞上皮細胞と血管内皮細胞を共培養することを考えている．そのため，今後多孔質ＰＤＭＳ膜作成および，肺胞上皮細胞と血管内皮細胞の共培養の方法に関する検討も同時に行う．
|
| Causes of Carryover |
伸展刺激装置はメーカーから購入予定であったが，当初購入を予定していた装置よりも上位機種の購入を検討したところ，予算オーバーになってしまった．そのため，自作できるところ（特にコントローラー）を製作したところ，当初予定していた物品費より支出額が少なくなった．
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
多孔質ＰＤＭＳ膜の作成ための実験素材，肺上皮細胞と血管内皮細胞の共培養系の確立ために培養液や試薬，また蛍光タンパク質の遺伝子導入試薬等に使用する．
|
