2015 Fiscal Year Research-status Report
衝撃ひずみ負荷による脳神経細胞の活動電位変化と軸索損傷の定量的評価
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26350509
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan University |
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Principal Investigator |
中楯 浩康 首都大学東京, システムデザイン学部, 助教 (10514987)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 細胞引張試験 / 衝撃ひずみ / 神経軸索損傷 / 細胞外電位記録 / 軸索伸長方向制御 / 神経幹細胞 / Tauタンパク質 / アミロイド前駆体タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，衝撃ひずみに負荷よる神経軸索損傷が脳神経細胞の電気的活動に与える影響を明らかにするため，培養神経細胞への引張荷重の印可と神経細胞からの細胞外電位の記録を１つの実験系で実施する．２７年度は，引張前後で同一細胞を観察・計測・評価するために，神経軸索の伸長方向を制御する方法を確立した．フォトリソグラフィとモールディングにより，PDMS（polydimethylsiloxane）基板に微小溝を作成し，凸部に細胞接着タンパク質を塗布，PDMS培養面に凸部をスタンプすることで細胞接着部位と非接着部位を選択的に作成した．細胞接着タンパク質をパターニングしたPDMS培養面にマウス神経幹細胞を播種，神経細胞とグリア細胞に分化させ，14日間以上培養できることを確認したが，10日前後で細胞非接着部位にも細胞が移動・接着していることが観察されたため，播種から実験までの培養期間は7日程度とした．また，前年度まで軸索損傷評価として観察していた軸索の形態的変化は，0.22以上の引張ひずみ負荷において認められたが，細胞外電位の計測は機能的評価であるため，より小さな引張ひずみ負荷により細胞電位が変化する可能性がある．もしくは，1度の引張ひずみ負荷では損傷しないが，繰り返し引張ひずみを与えることで損傷することも考えられる．今年度は，繰り返しの引張ひずみ負荷により軸索損傷が増大するかどうかを確認した．伸長方向を制御していない軸索に0.10の引張ひずみを1時間間隔で2回負荷し，1回引張に比較し2回引張において軸索膨張の有意な増加を認めたが，1回引張においても軸索膨張は観察された．軸索が損傷するかしないかのぎりぎりのひずみ値を探し出し，神経細胞に負荷する必要がある．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
２７年度は，神経軸索の伸長方向を制御する培養方法を確立し，その有用性を確かめた．当初の計画では，フォトリソグラフィとモールディングにより作成したPDMS製の微小溝を細胞培養面として使用する予定であったが，引張変位による微小溝の変形が著しく，細胞培養面内のひずみ分布が一様ではないため，作成した微細構造を応用し，細胞接着タンパク質がパターニングされたPDMS膜に変更した．本培養技術により，軸索膨張と細胞外電位を1細胞単位で同時に評価するという当初の計画に沿って研究が進展している．
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| Strategy for Future Research Activity |
２８年度は，マウス神経幹細胞を用いた細胞外電位計測を実施する．当初の計画通り，培養面に微小電極を作成し細胞外電位を取得する．前年度にラット脳切片とマイクロピペット型金属微小電極の組み合わせで細胞外電位を計測可能であることを確認している本計測システム，マウス神経幹細胞から分化させた培養神経細胞，市販のマルチ電極アレイディッシュの組み合わせで細胞外電位を計測可能であるかをまず確認する．計測できない場合は細胞種を市販のラット大脳皮質神経細胞に変更する．また，引張ひずみを負荷する培養面上への微小電極の材料として導電性ポリマーを検討する．引張変位による電極の導電性の変化をいかに低減できるかが課題である．
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| Causes of Carryover |
前年度の余剰分と他の研究課題との共通利用で実験消耗品を効率的に使用したため，物品執行額が当初予算額より減り次年度使用額が生じた．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
最終年度のため，実験結果を統計学的に解釈可能なだけの多くの実験を実施する．次年度は，脳神経細胞や培養試薬，軸索やアミロイド前駆体タンパク質やTauタンパク質を可視化するための抗体や蛍光試薬，培養チャンバーや微細構造付きスタンプを作成するためのPDMS，電極作製に必要な導電性ポリマーや関連試薬に使用する．
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