2014 Fiscal Year Research-status Report
再生心筋組織構築のための蛍光タンパク質を用いた評価系の確立
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26350515
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| Research Institution | Sophia University |
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Principal Investigator |
神澤 信行 上智大学, 理工学部, 教授 (40286761)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 心筋 / 蛍光タンパク質 / 拍動 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ES細胞の樹立やiPS細胞の開発に伴い再生医療への応用が広がりつつある。三次元化した組織の分化状態や機能性の評価は、従来とは異なる手法で迅速化することが求められている。本申請では、心筋組織再生の基盤技術として、繊維状のアパタイトからなるアパタイトファイバースキャフォルド(AFS)をモデル材料として使用し、また蛍光タンパク質を用いて心筋の拍動性を可視化できる細胞株を作製し、実際に三次元培養環境で評価することを目的としている。
本年度は、ラットの心筋に特異的なプロモーター下流にカルシウ濃度依存的に蛍光強度が変化するpG-CaMP を購入し、心筋特異的プロモーターを使用予定の培養細胞に合わせてマウスのゲノムから短離後、目的の位置にサブクローニングした。上記コンストラクトが正常に機能するかを確認するため、一過的にP19.CL6細胞に導入し、細胞分化に伴う蛍光強度の変化を調べた。その結果、期待通りに細胞の分化に伴って蛍光強度が増大し、明視野で心筋の拍動が確認されるのと同時に蛍光が明滅する様子が確認できた。現在はAFS内で培養することでどのように分化状態を観察できるのかを調べるとともに、上記コンストラクトを安定導入した細胞株の作製を進めている。
さらに、ギャップジャンクションを構成するコネキシン(Cx43)についても、Cx43特異的抗体を購入し、細胞の分化状態でどのように存在量が変化するか、タンパク質レベルで評価した。またcDNAレベルで発現量が変化するのかもPCRにより解析した。その結果、細胞の分化に伴う明確な量的変化は見られなかったが、翻訳後修飾が関与する可能性などが示唆される結果が得られてきた。今後はリン酸化を中心に解析を進めていく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請時、①心筋特異的プロモーターの単離、②プロモーターアッセイ、③G-CaMPへのプロモーターの組み込み、④モデル細胞への一過的遺伝子導入、⑤モデル細胞への安定的遺伝子導入、⑥培養皿上でのモデル細胞の蛍光測定、⑦生体材料上でのモデル細胞の蛍光測定、⑧Cx43の発現解析、という実験計画を立てた。この中で②に関しては実施していないが、文献調査によって実施の必要性がないとの結論を得ている。他①～④に関してはほぼ予定通り完成している。⑤から後半に関しては同時並行での繰り返しが必要であり、今後細胞株を変えて実施予定である。すでに長期培養実験に備えラジアルフロー型バイオリアクターを購入した。現在は予備実験を行っており、播種数や培養環境の最適化を行っている。上記のとおり、本実験は当初の予定通りに進行してる。
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| Strategy for Future Research Activity |
蛍光タンパク質を発現する細胞株に関しては、本年度の研究から機能することが確認できたため、⑤現在安定導入細胞を作製するため、遺伝子導入後、抗生剤によるスクリーニングを行い純化した細胞の短離を進めている。細胞によって感染効率が異なるため、今後の使い勝手も考慮しながら導入安定株を作製しようと考えている。⑥～⑧に関しては本年度、一種の細胞について解析を実施したが、今後他の細胞株でも解析を進め、作製した細胞株の有用性を評価していこうと考えている。
昨年度は、ギャップジャンクションに関与するCx43に関して解析を進めたが、拍動性の変化を見るためにはCx43だけでなく、細胞間接着に関与するインテグリンに関しても細胞分化に伴う変化を解析することが、拍動性との関連を調べる上で重要であると考え、今後追加で解析を進める予定である。
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Research Products
(3 results)
