2014 Fiscal Year Research-status Report
ナノ粒子による抗原特異的な免疫反応の制御とその細胞性機序の解明
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26350516
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| Research Institution | Tokyo Medical University |
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Principal Investigator |
矢那瀬 紀子 東京医科大学, 医学部, 講師 (10210303)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
水口 純一郎 東京医科大学, 医学部, 教授 (20150188)
秦 喜久美 東京医科大学, 医学部, 講師 (30287156)
豊田 博子 東京医科大学, 医学部, 助手 (80468660)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | がんワクチン / ナノテクノロジー / 樹状細胞 / CTL |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ナノ粒子（NPs）は目的とする組織・細胞への選択的な薬剤送達手段として用いられてきたが、近年免疫反応の制御法としても注目されている。今回、免疫反応をコントロールできるナノ粒子の開発を目的としている。すなわち、ナノ粒子にタンパク質を初めとする抗原や免疫増強物質（アジュバント）を内包し、さらに免疫細胞に対して選択的に反応する抗体を結合することによって効率的かつ選択的な免疫細胞（例えば、樹状細胞（DCs）ゃT細胞）の活性化を誘導し、液性免疫が感染予防に関わっている微生物の制御法及び細胞性免疫が主体をなしている悪性腫瘍に対する制御法の開発を目指している。
ナノ粒子に抗原として卵白アルブミン(OVA)（ペプチド）を結合させ、体液性免疫の制御法を検討する。特に用いる抗原量やアジュバントによって誘導される体液性免疫のアーム及びどのような影響を与えるかを検討した。さらに、抗腫瘍免疫反応（細胞性免疫反応）の内因性癌ペプチドを抗原として、アジュバント及び樹状細胞指向性を有している抗体を内包したナノ粒子製剤を作製し、腫瘍予防・治療ワクチンとしての可能性を模索する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1)体液性免疫応答機序の解析： NPsに卵白アルブミン(OVA)を粒子表面に結合した製剤を作製し、マウスの皮下に投与すると、血清中の抗原特異的な抗体産生が上昇し、アジュバント効果を発揮することを明らかにした（論文受理）。加えて今期は、体液性免疫応答のT細胞性機序について解析した。OVA-NPsで免疫されたマウス由来の脾臓からT細胞を純化し、in vitroで２次刺激を行い、産生されてくるサイトカインをフローサイトメーターによって解析したところ、PBS対照群と比較して有為にIFN-γ, IL-4, IL-21陽性T細胞が増加しており、T細胞がNPsのアジュバント効果に重要な働きをしていることを明らかにした。
２)癌ワクチンの作製：OVAをモデル腫瘍抗原として用いた系で、OVA-NPsが抗腫瘍免疫反応を誘導できること明らかにした。すなわちOVA-NPsを予めマウスに免疫しておくと、OVA発現腫瘍細胞(EG-7)のin vivoでの増殖は抑制された。さらに、腫瘍に対して抑制効果が期待できるIL-7を封入したOVA-NPs -IL-7を用いると、抗腫瘍効果が増強した。しかしOVA-NPs -IL-7は親細胞EL-4の増殖には影響を与えなかった。このことから、OVA抗原特異的な抗腫瘍免疫反応の誘導が予測されたので、細胞傷害性T細胞（CTL）反応の誘導を解析した。 テトラマー測定法を用いて、OVA257-264特異的なCTL(OVA-tetramer+,CD8+)の誘導の有無を検討したところ、OVA-Nps-IL-7を腫瘍接種の１週間前に投与した群ではCTL誘導が対照群に比べて著明に増加していた。以上の結果から、腫瘍抗原とIL-7を結合したNps製剤は効率よくCTLを誘導し、結果として腫瘍の退縮をもたらすと推測された。
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| Strategy for Future Research Activity |
内在性癌ペプチドを用いた癌ワクチンの作製：癌ペプチドが同定されているメラノーマ細胞株B16-F10を用いてNP製剤の抗腫瘍免疫の誘導能を検討する。１) 癌ペプチドTRP-2及びアジュバントCpG-ODNをナノ粒子に内包したワクチン製剤（NP-TRP2/CpG）を作製し、C57BL/6マウスに投与する。１週間後にB16-F10を皮下投与し、腫瘍サイズ、肺転移（サイズやコロニー数）、及び生存日数を測定する。TRP2/CpGおよびNP単独投与群をコントロールとする。２) 腫瘍組織における炎症性細胞浸潤の評価：腫瘍組織を採取し、単個細胞を得る。特異抗体を用いたフローサイトメーター法により浸潤細胞（T細胞、B細胞、DC、NK細胞など）を測定する。また、病理標本を作製し、浸潤細胞の程度を評価する。脾臓及び病巣局所のリンパ節における抗炎症性細胞（制御性T細胞、myeloid-derived suppressor cell （MDSC）など）を評価する。MDSC（CD11b+, Gr-1+）及び制御性T細胞（CD3+,CD4+, Foxp3+）はフローサイトメーターにより評価する。
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| Causes of Carryover |
実験が順調に進み、予定していた蛍光色素ラベル抗体の追加なしに解析実験ができたのが主な理由です。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
得られた結果から実験マウス数量を増やして再現性のある実験を試みる予定です。
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