脳梗塞モデルにおけるミクログリアとマクロファージが神経機能に与える影響の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26350591
• Research Institution: Nippon Medical School
• Principal Investigator: 西山 康裕 日本医科大学, 医学部, 助教 (20350077)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 脳虚血マウスモデル / ミクログリア / 炎症性サイトカイン / マクロファージ

Outline of Annual Research Achievements

実験動物として雄性１１－１４週齢のC57BL/6Jマウスを用い、３０分間の中大脳動脈閉塞sutureモデルを作成した。脳梗塞モデル作成後、翌日（day1）、day3, day5に脳細胞の単離を行った。すなわち、脳を取り出しホモジュナイズした後に、Liberase CI（Roche社製）を用いて６０分間インキュベートを行い、比重法にて回収した。その後CD45およびCD11bで染色し、flow cytometry（Becton Dickinson社）で解析を行い、ミクログリアであるCD45intおよびCD11bhighの部分にgateをかけ、FACS-Diva (Becton Dickinson社)を用いてsortingし、RNAを抽出。その後cDNAを合成した。 Sortingは冷却水をまわしながら行うことで、細胞の劣化を可能な限り防ぐ事が可能であった。各サンプルは３匹の脳細胞を混ぜることで、脳梗塞モデルの梗塞体積や動物間のばらつきを防ぐこととした。また、コントロールとして脳梗塞を作成しないC57BL/6Jマウスを同様に扱った。各群のサンプルから各種サイトカイン、ケモカインの解析を開始した。主な結果として、ミクログリアに特徴的なCXCR1の発現はコントロールに比してday1で劇的に発現量が減少し、その後day5にかけて徐々に増加した。その他、proinflammatory cytokineおよびanti-inflammatory cytokineを各種検索した。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

脳梗塞モデル作成、脳細胞単離、フローサイトメトリーでの解析およびFACS Divaでの細胞回収については、小さなトラブルはあったものの、おおむね順調に進んだ。しかしながら、回収したサンプルから得られるCT値が予想以上に高かったため、実験の遂行が困難であると考えたが、サンプル量と検索遺伝子の種類などを考慮し、TaqMan primer法で条件設定の変更などを行った。その結果、比較的満足が得られる結果を得たので、再度プランを組み直し、予定通りTaqMan primerを用いたサイトカイン検索を継続した。
問題は、その後当教室で方針が変更され基礎実験グループの大幅な縮小があり、モデルマウス作成からRNA抽出までの一連の実験を組むことが困難となり、他教室との共同実験を要望しているが、現時点で進展がないため実験の大幅な遅延及び計画の変更を予定している。

Strategy for Future Research Activity

現時点で残されたサンプルからデータを出し、論文化することが第一の目標。投稿後に再実験が要求される可能性があり、その際には可能な限りの対応を行う予定。cDNAは十分量のサンプルがあるため、各種proinflammatory cytokineおよびanti-inflammatory cytokineをrealtime PCRで検討していく。この結果をもとに、さらに新たなサイトカインなどのマーカーを検索したい。

Causes of Carryover

当教室での実験環境の大きな変化により、モデルマウス作成からRNA抽出までの実験を組むことが難しくなり、予算の縮小が得られた。今後はマウスモデルを外注することも想定している。

Expenditure Plan for Carryover Budget

今後は残されたサンプルを用いてDNA発現を網羅的にも行うことを検討し、マクロファージから得られた結果との比較により、脳梗塞後に起こるミクログリアと外来性マクロファージの連携などのメカニズムを検討していきたい。