2015 Fiscal Year Research-status Report
筋収縮により分泌が調節されている新規マイオカインの発見とその機能解析
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26350817
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan University |
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Principal Investigator |
眞鍋 康子 首都大学東京, 人間健康科学研究科, 准教授 (60467412)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | マイオカイン / 骨格筋 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、骨格筋から分泌される生理活性物質（マイオカイン）が、運動による健康の増進効果の一端を担っている可能性が指摘されている。本研究では、マイオカインの中でも特に筋収縮によって分泌が調節される新規マイオカインを発見するため、平成26年度までに、定量プロテオーム解析を用いて収縮した細胞から特異的に分泌されている16個の候補分子（収縮により分泌が上昇するもの14個、減少するもの2個）を選択した。Ｈ27年度は、それらの候補分子が実際に分泌されているか、また収縮による分泌の調節が確認できるかをウェスタンブロッティングで検証した。市販抗体が入手できるものに限定したため、収縮によって分泌が増加したもの10個、減少したもの1個の合計11個を対象にした。候補分子のうち2個は抗体による検出ができなかったが、残り9個のタンパク質に関しては、目的とされる位置にバンドが確認され、骨格筋細胞で発現し、分泌される事が明らかになった。その一方、ウェスタンブロッティングによる検証では、収縮後に分泌の差が観察されなかった。プロテオーム解析はその手法や機器によっても得られるデータが異なることから、プロテオーム解析に使用する機器を変更し、再度検証した。その結果、分泌による上昇が2個、減少する蛋白質1個が調節性マイオカインとして選択された。しかし、1回目と同様にウェスタンブロッティングでは収縮による分泌の変化は見られなかった。以上の結果は、マイオカインは調節性よりも構成性に分泌されるものが多数であることを示している。そのため現在は、構成性に分泌される蛋白質を対象に、マイオカインとしての可能性を探っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成26年度に実施したプロテオーム解析では調節性マイオカインは発見されなかったことから、平成27年度はプロテオーム解析に使用する機器を変更し、再度プロテオーム解析を実施した。しかし、昨年度と同様に調節性マイオカインは発見されなかった。我々の使用しているモデルや解析手法が分泌タンパク質の検出に適切でない可能性も考えられたため、既報で調節性マイオカインとして知られているInterleukin-6に関して、今回用いた濃縮・検出方法で筋収縮により分泌が調節されるかを検証したところ、収縮により分泌が増加するものとして検出された。以上の結果は、今回用いた方法による調節性タンパク質の検出が可能であることを示している。さらに、マイオカインは、構成性に分泌されているものが多数で、急性に分泌調節されるものは少ないと考えられる。そこで、プロテオーム解析で発見された分子のうち、調節性・構成性にかかわらず興味深い分子についての分泌の検証を行うことにした。選択された分子の中で、分子番号＃9は、6K以下の低分子量で、他の臓器では分泌タンパク質として知られているが、これまで骨格筋での発現や分泌は知られていない。そこで、この分子に注目し、骨格筋組織や細胞を用い発現を検証したところ、＃9はタンパク質として骨格筋に発現していることが明らかになった。今後は発現しているタンパク質が実際に分泌されるかを検証していく。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度のプロテオーム解析の結果から、分泌様タンパク質＃9が調節性分泌か構成性分泌かについては明らかにはできなかったが、骨格筋に発現していることは明確になった。＃9は他の臓器での発現が既に知られており、その定量にはELISA法が使用されている。これまでに＃9の抗体を用いたウェスタンブロッティングによる検証では、目的の分子量の位置にバンドが得られたが、他臓器との発現量の違いが明確にはならなかった。そこで、ELISA法を用いて、他臓器と骨格筋における＃9の発現量の違いを明確にする。さらに、＃9の分泌タンパク質としての性質を明らかにするために、過剰発現させた細胞を作製する。まず、マウス骨格筋からcDNAをクローニングしてタグをつけ、細胞にトランスフェクションする。その培養上清を濃縮し分泌されるかを検証する。さらに、in vivo エレクトロポレーション法により生きたマウスの下肢骨格筋に過剰発現させる。タンパク質の発現を待ってから、骨格筋由来のタグ付きマイオカインが血液中に検出されるかを検証する。これまでの結果からは＃9が調節性マイオカインである可能性は低いという結果を得ているが、抗体の力価の問題で内因性の発現量では差を検出できなかった可能性も考えられるため、過剰発現細胞においても、収縮の有無による分泌の調節があるかの確認を行う。マイオカインの分泌様式の検証や、マイオカインの生理作用に関しては、平成28年度以降に新たな研究費を得て、研究を継続する予定である。
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| Causes of Carryover |
物品をキャンペーン価格で購入したり、試薬の量を減らして節約する実験を実施したため、物品費を予定より少なく使用した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
最終年度は、目的の蛋白質の性質をELISAキットを用いて検証したり、遺伝子を扱う研究を実施するため、それらのキットの購入に使用する。
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