2014 Fiscal Year Research-status Report
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26350921
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| Research Institution | National Defense Medical College |
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Principal Investigator |
石塚 俊晶 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究, 医学教育部医学科専門課程, 教授 (30399117)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 豪 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究, 医学教育部医学科専門課程, 講師 (50649035)
渡辺 康裕 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究, 医学教育部医学科専門課程, 名誉教授 (90127324)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 神経幹細胞 / 神経分化 / 酸化LDL / 酸化LDL受容体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
高脂肪食で飼育し脂質異常症を呈したマウスやラットでは、海馬歯状回での神経新生が低下していることから、脂質異常症の病態への関与が示唆される酸化LDLおよびHDLが神経幹細胞の増殖および分化に直接影響を及ぼしている可能性が考えられる。そこで、今回、マウス人工多能性幹細胞(iPS細胞)より神経幹細胞、さらに神経細胞への分化過程における酸化LDLおよびHDL刺激の影響を検討した。まず、マウスiPS細胞を低接着性ディッシュにて培養しレチノイン酸 3 microMを加えて胚様体を形成させ、4日後にフィブロネクチンにて接着させてからノギン 20 ng/mlを加えさらに7～14日間培養し、神経幹細胞へ分化誘導を行った。マウスiPS細胞および分化誘導された神経幹細胞において、酸化LDLおよびHDL受容体の発現が蛍光抗体染色にて確認された。さらに、レチノイン酸およびノギン添加時に酸化LDL 1～10 microg/mlを同時に加えると、分化に伴い誘導される神経幹細胞のマーカー Nestinの発現が有意に抑制された。一方、HDL 1～10 microg/mlの刺激は、レチノイン酸およびノギンによるNestinの発現誘導に対して有意な影響を与えなかった。次に、マウスiPS細胞由来神経幹細胞にノギン 20 ng/mlを加えさらに7～14日間培養し、神経細胞への分化誘導を行った。酸化LDLあるいはHDL 1～10 microg/mlを同時に加えたが、分化に伴い誘導される神経細胞のマーカー MAP2の発現には有意な影響を与えなかった。以上の結果より、酸化LDLの刺激はマウス多能性幹細胞から神経幹細胞への分化に対して抑制的に作用するが、神経幹細胞から神経細胞への分化に対しては影響しないことが示唆された。また、HDLの刺激はいずれの分化過程にも影響しないことが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
今回、マウスiPS細胞より神経幹細胞、さらに神経細胞への分化過程における酸化LDLおよびHDL刺激の影響を検討した。一方、神経幹細胞の増殖に対する影響に関しては、セルカウンターによる細胞数計測を行っており、現在、MTTアッセイによる確認実験を行っているところである。また、神経幹細胞のノルアドレナリン、セロトニン分泌に対する影響は、細胞抽出液および細胞培養上清を用いて解析を行っているが、高速液体クロマトグラフィーの不調により検討が中断している。さらに、マウスの海馬や側脳室周囲に酸化LDLやHDLを投与しin vivoでの神経新生に対する影響を検討する予定であったが、学内の動物実験倫理委員会の承認が遅れたため、現在、実験準備の段階である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回、酸化LDLおよびHDL刺激は、通常培養環境では、マウスiPS細胞由来神経幹細胞の神経細胞への分化過程において明らかな影響を与えなかった。しかし、神経幹細胞は低酸素環境において細胞増殖や神経細胞への分化が促進することが報告されており、低酸素環境にて酸化LDLおよびHDL刺激が何らかの影響を与える可能性がある。そこで、今後は、マウスiPS細胞由来神経幹細胞を低酸素環境(1～5% O2)にて培養し、低酸素環境における細胞増殖、神経細胞への分化、ノルアドレナリンやセロトニン分泌に対する酸化LDLおよびHDL刺激の影響を検討する。また、正常マウスの脳を単離し、海馬や側脳室周囲を含む脳組織切片を作成し、低酸素環境にて培養し、ex vivoでの神経新生に対する酸化LDLおよびHDL刺激の影響を合わせて検討する。
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| Causes of Carryover |
H26年度は、神経幹細胞のノルアドレナリン、セロトニン分泌に対する酸化LDLやHDL刺激の影響を、細胞抽出液および細胞培養上清を用いて解析を行う予定であったが、高速液体クロマトグラフィーの不調により実験が中断している。さらに、マウスの海馬や側脳室周囲に酸化LDLやHDLを投与しin vivoでの神経新生に対する影響を検討する予定であったが、学内の動物実験倫理委員会の承認が遅れ、現在、実験準備の段階である。これらの事情により、高速液体クロマトグラフィーで使用予定の試薬・消耗品類、マウスの購入・飼育費、海馬・側脳室周囲の組織染色やマウスの行動実験解析に必要な試薬・消耗品類が未使用であった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
H27年度は、まず、高速液体クロマトグラフィーによるマウスiPS細胞由来神経幹細胞の細胞抽出液および細胞培養上清のノルアドレナリン、セロトニン分泌量の測定を行う。また、マウスの海馬や側脳室周囲に酸化LDLやHDLを投与しin vivoでの神経新生に対する影響を検討する。その後、マウス神経幹細胞を低酸素環境(1～5% O2)にて培養し、低酸素環境における細胞増殖、神経細胞への分化に対する酸化LDLおよびHDL刺激の影響を検討する。さらに、正常マウスの脳を単離し、海馬や側脳室周囲を含む脳組織切片を作成し、低酸素環境にて培養し、ex vivoでの神経新生に対する酸化LDLおよびHDL刺激の影響を合わせて検討する。このため、前半部分の実験にはH26年度に未使用であった試薬・消耗品類が必要となり、後半部分の実験にはH27年度に計画している予算額を使用する予定である。
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Research Products
(11 results)
